Worldwide China

KITS ARRAYS

Elisa-Test zum direkten Nachweis von Mykoplasma bovis

11.09.2006 | Autor / Redakteur: ELVIRA SCHECKLIES*, ROLF HOFSTETTER** und SIEGHARDT FRIESCHMANN*** /

Abb.1: Der pab-Elisa- Stick auf Basis nachwachsender Rohstoffe.
Abb.1: Der pab-Elisa- Stick auf Basis nachwachsender Rohstoffe.

Ein neuer Capture-Elisa, bei dem ein Immunostick-Küvetten-System ausnachwachsenden Rohstoffen eingesetzt wird, ermöglicht den direkten Nachweis von Mykoplasma bovis in Serum, Milch oder Nasentupferproben. Der Einsatz und die Entsorgung von Lösungsmitteln, Puffern und Zellkulturmedien wird dadurch vermieden.

Ein neuer Capture-Elisa, bei dem ein Immunostick-Küvetten-System ausnachwachsenden Rohstoffen eingesetzt wird, ermöglicht den direkten Nachweis von Mykoplasma bovis in Serum, Milch oder Nasentupferproben. Der Einsatz und die Entsorgung von Lösungsmitteln,Puffern und Zellkulturmedien wird dadurch vermieden.

Häufig unbemerkt haben sich Bakterien der Art Mykoplasma bovis in europäischen Rinderbeständen verbreitet und richten massive Schäden an. Neben Viren wird eine Vielzahl von Bakterien als Erreger von Lungenerkrankungen nachgewiesen. Hier stehen Keime wie Mykoplasma bovis, im Vordergrund. Mykoplasma bovis ist einer der weltweit bedeutendsten Erreger von Mykoplasmen-Infektionen bei Rindern, die mit erheblichen wirtschaftlichen Verlusten einhergehen.

Die wichtigsten Krankheitsbilder, die von diesem Erreger verursacht werden, sind Pneumonien und Gelenksentzündungen bei Kälbern und Jungrindern sowie Mastitis bei Kühen. Die wirtschaftlichen Verluste werden auch dadurch verstärkt, dass in vielen Ländern Mykoplasmen bei der Routinediagnostik nicht berücksichtigt und daher nicht immer als Ursache erkannt werden. Mit PCR-Tests oder konventionellen mikrobiologischen Untersuchungen kann die Anwesenheit von Mykoplasma bovis in Blut, aus Tupfern und in Milchproben nachgewiesen werden.

Da PCR-Tests kostenintensiv sind, geschultes Personal für die Durchführung notwendig ist, und mikrobiologische Untersuchungen ebenfalls einen nicht unerheblichen Laborbedarf und Zeitaufwand benötigen, wurden auch enzymimmunologische Testverfahren (Elisa) mit spezifischen Antikörpern gegen Mykoplasmen entwickelt. Elisa-Systeme sind eine gute Methode, um nicht nur spezifische Moleküle, sondern auch Mikroorganismen in Pflanzen, Nahrungsmitteln oder Tieren schnell und kostengünstig nachzuweisen. Diese Tests werden bisher in Mikrotiterplatten durchgeführt. Dennoch muss, wie bei anderen analytischen Methoden, das Probenmaterial auch für Elisas auf Mikrotiterplatten für den Test aufbereitet werden. Verschiedene Arbeitsschritte und erhöhter Zeitaufwand sind dabei notwendig.

Immunosticks als Alternative

Ein neu entwickeltes Immunostick-Küvetten-System, der pab-Elisa-Stick, auf der Basis von nachwachsenden Rohstoffen, erlaubt es im Gegensatz dazu, spezifisch u.a. Mikroorganismen ohne Vorarbeiten zu detektieren. Neuartige, beflockte Abstrichtupfer ermöglichen eine einfache Probennahme und effektive Analyse.

Die pab-Elisa-Sticks bestehen aus dem nachwachsenden Rohstoff Polyhydroxybuttersäure (PHB). PHB ist ein thermoplastisch verarbeitbarer Polyester mit ungewöhnlichen Oberflächeneigenschaften und der chemischen Formel -[O-CH(CH3)-CH2-CO]-. Das ß-Kohlenstoffatom des Monomers ist optisch aktiv (R-Konfiguration). PHB ist ein Biopolymer, das in allen Lebewesen vorkommt. Viele Bakterien beispielsweise produzieren PHB in großen Mengen als Reservestoff (wie Öl oder Stärke). Es ist ungiftig und wird biologisch ohne schädliche Rückstände abgebaut. PHB ist eine Nahrungsquelle für Bakterien und Pilze.

Es kann aber nur dann abgebaut werden, wenn Phosphate, Stickstoff, Salze, Wärme und Feuchtigkeit das Wachstum von Mikroorganismen zulassen. Diese Voraussetzungen findet man im Kompost und im Boden, nicht jedoch unter normalen Gebrauchsbedingungen. Daher sind Artikel aus PHB unter normalen Umständen über mehrere Jahre haltbar. Die Oberfläche des Stick ist für adhäsive Bindungen ebenso wie für kovalente einsetzbar - durch Inkorporation funktioneller Gruppen in die Polymermatrix.

Basierend auf der chemischen Struktur eines Polyesters hat die Oberfläche Vorteile im Vergleich zu konventionellen Polystyrolprodukten:

-Niedriger Background-Hohe Affinität bei verbesserter Standardkurve-hydrophile Oberfläche?-niedriger Variationskoeffizient -verbesserte Bindungskapazität für beispielsweise Konjugate, Peptide oder kleinere Moleküle.

Die Anwendung des speziell entwickelten Immunosticks in Form eines innovativen Immunostick-Küvetten-Systems ist eine alternative Methode zu anderen analytischen Methoden wie Elisa in Mikrotiterplatten, PCR oder mikrobiologischen Methoden. Bei diesem System können selbst unlösliche Materialien ohne Probenaufarbeitung analysiert werden.

Der pab-Elisa-Stick ist kompatibel mit einer Halbmikroküvette, die gleichzeitig als Reaktionsgefäß für die einzelnen Testschritte dient. Alle Inkubationen sowie die abschließende photometrische Messung können ohne Umpipettierung direkt in der Küvette durchgeführt werden. Die Küvetten können in jedem Standardphotometer gemessen werden. Grundsätzlich können alle Elisa-Verfahren, die bisher mit Mikrotiterplatten durchgeführt werden, auf das Stick-System übertragen werden, ohne die Testbedingungen zu modifizieren.

In der hier beschriebenen Applikation wurde reines Mykoplasma bovis-Antigen präpariert und in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) suspendiert. Diese Suspension wurde mit Biopolymermikropartikeln inkubiert, um die Mykoplasmen an die Oberfläche zu binden. Dies hat den Effekt, dass das Antigen auf der Oberfläche stabilisiert wird und so den Stoffwechsel des immunisierten Tieres nicht beeinflussen kann.

Zusätzlich besitzen die Partikel sowohl einen Depot- als auch einen Adjuvanseffekt. Mit dieser Suspension wurden Kaninchen dreimal subkutan und einmal intramuskulär innerhalb von fünf Wochen immunisiert. Danach erfolgte die erste Blutentnahme. Zur weiteren Antikörperproduktion wurden die Tiere einmal pro Monat nachimmunisiert, gefolgt von jeweils zwei Blutentnahmen. Die einzelnen Serumfraktionen wurden hinsichtlich ihres Titers gegen das Immunogen getestet.

Die Besten wurden gepoolt, um einen größeren Vorrat an äquivalentem Serum zu erhalten. Aus diesem Pool erfolgte die Aufreinigung der IgG-Fraktion unter Verwendung von Protein A-Sepharose-Säulen. Dabei inkubierte man zunächst das Rohserum auf der Säule. Während der Inkubationszeit bindet der Fc-Teil der Immunoglobuline an Protein A. Um nicht gebundene Komponenten zu entfernen, wurde die Säule mit PBS gewaschen. Danach erfolgte die Elution der IgG mittels eines Zitratpuffers, pH 2. Die Proteine wurden gegen destilliertes Wasser dialysiert, aliquotiert und lyophilisiert. Die Aliquots werden bis zur Verwendung tiefgefroren gelagert (Zur genauen Durchführung des Elisa-Tests auf pab-Sticks siehe Kasten „Durchführung“).

Schlussfolgerungen

Ein neu entwickeltes Immunostick-Küvettensystem für Elisa-Verfahren (Capture-Elisa) ermöglicht die direkte spezifische Detektion von Komponenten ohne Probenaufarbeitung, Isolierung, Anreicherung oder Kultivierung von Probenmaterial.

Die Analyse kann dabei vor Ort kostengünstig und schnell ohne apparativen Aufwand oder geschultes Personal durchgeführt werden. Die Ergebnisse sind sowohl visuell mit Präzipitationssubstrat als auch mit einem Photometer auswertbar. Die visuelle Detektion ermöglicht eine semiquantitative Bestimmung anhand der Farbintensität auf dem Stick. Bei positivem Resultat können so zeitnah weitere Maßnahmen in die Wege geleitet werden. Die verwendeten beflockten Tupfer sind Elisa-kompatibel und unterstützen durch die hochgradige Abgabe des aufgenommenen Probenmaterials die Sensitivität der Immunosticks.

Durchführung

Elisa-Test auf Mykoplasma bovis mit pab-Elisa-Sticks

Die Proben werden homogenisiert. Serum-bzw. Milchproben werden direkt eingesetzt. Nasentupferproben versetzt man mit PBS, in das dann der Stick getaucht wird. Jeweils ein 0,5 ml Aliquot wird in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt, in dem der Stick etwa eine Stunde inkubiert wird. Dann wäscht man den Stick mit Wasser. Um unspezifische Bindungsstellen abzublocken, wird der Stick in der Halbmikroküvette mit einer Blocklösung inkubiert, bestehend zum Beispiel aus 0,1 Prozent Rinderserumalbumin oder Tween 20 in 1 ml PBS. Die Inkubationszeit beträgt dabei zwei Stunden.

Danach werden Stick und Küvette gewaschen.Die Küvette befüllt man mit 1 ml IgG-Lösung in PBS und inkubiert für eine Stunde. Nach einem weiteren Waschschritt wird der Stick in 1 ml ProteinA-Enyzmlösung (in PBS) überführt und für 30 Minuten stehen gelassen. Anstelle der zwei Inkubationsschritte IgG und Protein A-Enzym kann ebenso direkt ein IgG-Enzym-Konjugat eingesetzt werden.

Nach einem abschließenden Waschschritt gibt man den Stick in eine neue Küvette mit Substratlösung. Das auf dem Stick gebundene Enzym bewirkt nun die Farbreaktion für die optischeDetektion. Das Ergebnis kann durch lösliche oder Präzipitationssubstrate bestimmt werden. Im Fall eines positiven Befundes ist bei der Verwendung von Präzipitationssubstrat eine unterschiedliche Färbung auf den Stick zu erkennen. Bei Verwendung von löslichen Substraten wird die Küvette im Photometer gemessen und die erhaltenen Extinktionswerte ausgewertet.

*E. Schecklies, pab productions, 85241 Hebertshausen**Dr. R. Hofstetter, Tierarztpraxis am Stadtweiher, 85221 Dachau***Dr. S. Frischmann, Mast Diagnostica, 23858 Reinfeld

Kommentare werden geladen....

Kommentar zu diesem Artikel abgeben

Der Kommentar wird durch einen Redakteur geprüft und in Kürze freigeschaltet.

  1. Avatar
    Avatar
    Bearbeitet von am
    Bearbeitet von am
    1. Avatar
      Avatar
      Bearbeitet von am
      Bearbeitet von am

Kommentare werden geladen....

Kommentar melden

Melden Sie diesen Kommentar, wenn dieser nicht den Richtlinien entspricht.

Kommentar Freigeben

Der untenstehende Text wird an den Kommentator gesendet, falls dieser eine Email-hinterlegt hat.

Freigabe entfernen

Der untenstehende Text wird an den Kommentator gesendet, falls dieser eine Email-hinterlegt hat.

copyright

Dieser Beitrag ist urheberrechtlich geschützt. Sie wollen ihn für Ihre Zwecke verwenden? Infos finden Sie unter www.mycontentfactory.de (ID: 180029 / Bio- & Pharmaanalytik)