Fettsäuren Fettsäuren vollautomatisiert derivatisieren und bestimmen

Fettsäuren lassen sich gaschromatographisch nicht direkt untersuchen. Die notwendige Probenvorbereitung kostet viel Zeit und beinhaltet zahlreiche Fehlerquellen. Eine Automatisierierung der Probenvorbereitung, einschließlich Standardaddition und Derivatisierung, bis hin zur diskriminierungsfreien Injektion in das GC, bringt neben der Zeitersparnis auch einen deutlichen Sicherheitsgewinn mit sich.

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Shimadzu Deutschland GmbH

Socorex Isba SA

Je komplexer die Analytik, desto höher die Anforderungen, die ein Laborroboter erfüllen muss. Einen idealen Freiheitsgrad haben solche Geräte, die die Funktion von zwei Robotern für das Handling flüssiger Proben in sich vereinen. Wie etwa die Gerstel-MPS-Prepstation (s. Abb. 1), die von John Colwell, Bespak Europe, sowie Ray Perkins, Keith Summerhill und Jonathan Angove von Anatune in England zur Analyse von Fettsäuren eingesetzt wird.

Direkte Chromatographie von Fettsäuren ist nicht möglich

Tierische und pflanzliche Fette spielen als Bestandteil unserer Ernährung sowie als Schmier- und Gleitmittel eine wichtige Rolle. Ihre Analytik hat die Aufgabe, nicht nur den Reinheitsgrad von Fett und Öl zu untersuchen, sondern auch zu Deklarationszwecken den Fettgehalt und die -zusammensetzung in Lebensmitteln zu bestimmen. Fette und fette Öle sind Ester des dreiwertigen Alkohols Glycerin (Propan-1,2,3-triol) mit drei, meist verschiedenen, überwiegend geradzahligen und unverzweigten aliphatischen Monocarbonsäuren. Sie werden auch als Fettsäuren bezeichnet, anhand derer man Fette charakterisieren kann. Verbindungen dieser Art werden Triglyceride beziehungsweise Triacylglycerine genannt.

Tricglyceride lassen sich allerdings chromatographisch nicht analysieren. Dafür bedarf es ihrer Spaltung und Derivatisierung: Die Esterverbindungen werden aufgebrochen und die freien Fettsäuren in korrespondierende Fettsäuremethylester (FAME, Fatty Acid Methyl Ester) überführt. Im Gegensatz zu den jeweiligen Fettsäuren sind FAMEs unpolar und moderat flüchtig und eignen sich für die GC-Analyse.

Der Schritt der Fettsäurenderivatisierung ist für gewöhnlich arbeitsintensiv; eine Automatisierung der Probenvorbereitung, wie es Colwell, Perkins, Summerhill und Angove unternommen haben, drängt sich geradezu auf. Die Wissenschaftler haben die vielfach beschriebene manuelle Derivatisierung mit Bortrifluorid und Methanol adaptiert und auf die MPS-Prepstation von Gerstel übertragen. Die Vergleichbarkeit war bei dieser Methode gewährleistet, wie die Ergebnisse zeigen.

Zunächst wurden die Fettproben in 10-mL-Vials mittels Accelerated Solvent Extraction (ASE) aufgeschlossen und mit deuterierten Fettsäuren versetzt. Die resultierenden Extrakte wurden bis zur Trockene eingedampft. Alle weiteren Schritte erfolgten automatisiert auf der MPS-Prepstation. Die Analyse erfolgte unter Zugabe von 1-Bromtetradecan als internem Standard.

Die technischen Details der Automationslösung

Entscheidend für die effiziente Automatisierung der Fettsäurenderivatisierung ist, dass sich alle erforderlichen Arbeitsabläufe auf dem Autosampler durchführen lassen. Die Prepstation verfügt über zwei übereinander gelagerte Achsen (Schienen), an denen sich jeweils ein Roboterarm entlang bewegt, der in allen drei Raumrichtungen agieren kann. „Während die obere Schiene etwa das gesamte Spektrum der Flüssigaufgabe abdeckt, inklusive Stan-dardaddition und Derivatisierung, kann die zweite Schiene eine weitere Möglichkeit der Probenanreicherung und Probenaufgabe bieten wie Headspace, SPME oder SBSE“, erklärt Ray Perkins. Die Plattform ermögliche es so, selbst komplexe Analysen effizient, komfortabel und zeitlich verschachtelt durchzuführen, was insbesondere dann interessant ist, wenn es sich um sensible, leicht zerstörbare Proben handelt und Substanzverlust im derivatisierten Zustand zu erwarten ist.

Die bei der Fettsäureanalytik eingesetzte Prepstation war mit einer 1-µL- und einer 10-µL-Spritze ausgestattet sowie mit zwei beheizbaren Agitatoren und einer Lösemittelstation, die Platz für vier Lösemittelbehälter bietet. Zwei enthielten Wasser der Qualitätsstufe HPLC-Grade, einer Aceton. Der in Hexan gelöste interne Standard sowie das Derivatisierungsreagenz (BF3 in Methanol) wurden in je einem 100-mL-Vial bevorratet. Kontrolliert und gesteuert wurde die Probenvorbereitung mittels der Gerstel-Maestro-Software. Die anschließende Analyse erfolgte auf einer Kombination GC 6890 und MSD 5973 von Agilent Technologies. „Unsere Gerätekonfiguration erlaubt es“, erklären die Wissenschaftler, „Probenvorbereitung, Probenaufgabe und Analyse nahtlos ineinander übergehen zu lassen oder wahlweise jeden einzelnen Schritt unabhängig voneinander, also die GC/MS-Analyse getrennt durchzuführen.“

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