HILIC-Tipps, Teil 5 Salze für die mobile HILIC-Phase richtig einstellen

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Der Zusatz von Salz zur mobilen HILIC-Phase verbessert die Reproduzierbarkeit und Peakform und optimiert so die Trennqualität. Doch welche Salze eignen sich besonders gut? Wie lassen sie sich zuverlässig in mobilen Phasen mit hohem Acetonitril-Anteil lösen? Und welchen Einfluss haben Salze auf die Trennung?

Typischerweise werden der mobilen Phase Salze zugesetzt, um die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen geladenen Analyten und der stationären Phase kontrollieren zu können. Dies verbessert die Peakformen der eluierenden Analyten durch ein geringeres Peak-Tailing. Dabei gibt es einiges zu beachten.

Geeignete Salze für die HILIC

Normalerweise werden in der HILIC Salze wie Ammoniumacetat und Ammoniumformiat eingesetzt, manchmal auch Ammoniumbikarbonat (s. Abb. 2). Diese Salze lösen sich interessanterweise auch in Lösungsmittelmischungen, die hohe Gehalte an Acetonitril aufweisen, wie es in der HILIC zu Beginn der Läufe typisch ist. Gleichzeitig sind diese Salze aufgrund ihrer Flüchtigkeit kompatibel mit der anschließenden massenspektrometrischen Detektion, welche eine häufig genutzte Detektionstechnik für HILIC darstellt. Eine Verwendung von weniger gut löslichen Salzen wie Phosphaten oder von Ionenpaarreagenzien wie TFA sollte nach Möglichkeit vermieden werden, sofern eine MS-Detektion angedacht ist. Nutzt man allerdings spektroskopische Detektoren so können durchaus „nicht flüchtige“ Salze Verwendung finden. Solche Substanzen weisen verstärkt so genannte Aussalzeffekte auf und können kosmotropische und chaotropische Effekte auf geladene Moleküle haben, also Wasserstoffbrückenbindungen stärken oder stören [1]. Dies würde an dieser Stelle aber zu weit führen und kann in Andrew J. Alperts Schriften nachgelesen werden.

Die meisten mobilen HILIC-Phasen werden also mit dem Zusatz von Ammoniumacetat oder Ammoniumformiat hergestellt. Beide Salze sind nicht identisch nutzbar, da Ammoniumformiat in der mobilen Phase einen stärker sauren pH-Wert ergibt als Ammoniumacetat.

Eine Mischung beider Salze ermöglicht es, den pH-Wert der mobilen Phase gezielt in einem gewissen Bereich einzustellen.

Einfluss des Salzgehalts

Der grundsätzliche Effekt des Salzgehalts in der mobilen Phase ist wie folgt zu beschreiben: Salze beeinflussen die elektrostatischen Wechselwirkungen von geladenen Molekülen mit geladenen oder zwitterionischen Säulenmaterialien (s. HILIC-Tipp 3). Im Falle der elektrostatischen Anziehung zwischen Analyten und stationärer Phase gilt folgendes: Die Erhöhung des Salzgehalts führt zu einer verringerten Retention.

Dementsprechend gilt bei elektrostatischer Abstoßung zwischen Analyten und stationärer Phase das Umgekehrte: Die Erhöhung des Salzgehalts führt zu einer erhöhten Retention des entsprechenden Analyten.

Der zweite Effekt der Nutzung von Salzen bzw. einer Erhöhung des Salzgehalts in der mobilen Phase zeigt sich in der Dicke der Wasserschicht auf der Oberfläche von polaren HILIC-Materialien. Der hohe Gehalt an organischem Laufmittel in der mobilen Phase zu Beginn einer Trennung zwingt das Salz dazu, sich bevorzugt in der Wasserschicht anzureichern. Eine zunehmende Salzkonzentration führt somit zu einer zunehmenden Dicke der Wasserschicht, was grundsätzlich einhergeht mit einer stärkeren Retention aller polarer Analyten (Ausnahme s. o.). Daher führt ein signifikanter Salzgehalt auch für polare, nicht-geladene Analyten zu einer erhöhten Retention, selbst wenn diese keine elektrostatische Wechselwirkung ausbilden können. Ein erklärendes Schema hierzu findet sich in Abbildung 2. Die zugrunde liegenden Arbeiten wurden von uns bereits vor rund 15 Jahren an der ZIC-HILIC-Phase durchgeführt und in einer Publikation veröffentlicht [2].

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Herstellung der mobilen Phase

Für eine ausreichende Reproduzierbarkeit von Retention und Peakform ist es notwendig, in der mobilen Phase eine finale Salzkonzentration von mindestens 5 mmol/L zu haben und diese Konzentration dauerhaft stabil zu halten. Die Einflüsse eines Salzgradienten haben wir an anderer Stelle diskutiert und werden sie hier nicht berücksichtigen [3]. Die Löslichkeit der Salze in der mobilen Phase mit hohem organischem Lösungsmittelanteil kann sich allerdings als problematisch erweisen und führt oft zu Präzipitation der Salze in der Lösung.

Bei mobilen Phasen mit einem Acetonitrilanteil von 95 % sollte die Salzkonzentration aufgrund der begrenzten Löslichkeit zunächst unter 15 mmol/L gehalten werden.

Eine konventionelle Vorgehensweise zur Herstellung mobiler Phasen für die HILIC ist in Abbildung 3 dargestellt. Als Beispiel soll 1 L einer mobilen Phase aus Acetonitril/Wasser (95:5, v/v) mit einer finalen Ammoniumacetatkonzentration von 10 mmol/L hergestellt werden. Entscheidend ist dabei, dass das Ammoniumacetat zunächst vollständig in reinem Wasser gelöst wird. Hierzu werden zunächst 50 mL einer wässrigen Ammoniumacetatlösung mit einer Konzentration von 200 mmol/L angesetzt. Durch einfaches Rühren löst sich das Salz innerhalb weniger Sekunden vollständig im Wasser. Anschließend werden unter kontinuierlichem Rühren langsam 950 mL Acetonitril zu den 50 mL der wässrigen Ammoniumacetatlösung gegeben. Auf diese Weise erhält man 1 L einer mobilen Phase mit einem Acetonitril/Wasser-Verhältnis von 95:5 (v/v) und einer finalen Ammoniumacetatkonzentration von 10 mmol/L.

Die finale Lösung kann nun auf der Bodenfläche der Flasche trübe kleine Kügelchen aufweisen. Dies zeigt eine nicht perfekte Lösung des Salzes in der mobilen Phase an. Die Verwendung von transparenten Glasflaschen kann in der Überwachung dieses Effektes helfen. Kräftiges Rühren, vielleicht sogar über Nacht, wird die Salzlöslichkeit nicht verbessern. Um das Salz aber vollständig in Lösung zu bringen, sollte man die Flasche mit der Lösung in einem Ultraschallbad beschallen, bis die Lösung durchsichtig wird und die Tröpfchen oder Partikel verschwunden sind. Normalerweise ist eine 30-minütige Beschallung vollkommend ausreichend.

Sobald das Salz vollständig gelöst ist, kann die mobile Phase wie gewohnt filtriert werden und steht anschließend direkt für die chromatographische Anwendung zur Verfügung. Dieses Vorgehen lässt sich auch auf andere mobile HILIC-Phasen übertragen und bei Bedarf modifizieren. Wassergehalt, Salzart und Salzkonzentration können dabei gezielt an die jeweilige Anwendung angepasst werden. Wichtig ist zudem eine reproduzierbare Ultraschallbehandlung. Insbesondere Beschallungsintensität und -dauer sollten stets konstant gehalten werden.

Effekt des Salzgehalts

Zusätzlich zum Einfluss auf die elektrostatischen Wechselwirkungen beeinflusst die Salzkonzentration die Dicke der Wasserschicht, wodurch auch die Retention ungeladener Verbindungen beeinträchtigt wird. Ein hoher Prozentsatz von organischem Lösungsmittel im Eluent bewirkt, dass Salz bevorzugt in die Wasserschicht gedrängt wird. Eine Erhöhung der Salzkonzentration führt so konsequent zu einer dickeren Wasserschicht. Dieser doppelte Effekt der Salzkonzentration ist in einigen Trennungen zu beobachten. Beispiel:

Trennung von 2-Hydroxy-Benzoesäure und 4-Hydroxy-Benzoesäure (2-HB und 4-HB; in Abbildung 4 gekennzeichnet als Nr.1 und Nr.2) auf drei Säulen mit unterschiedlichen Eigenschaften (wie in Abbildung 4 gezeigt und dem Original [3] entnommen). Bei neutralem pH-Wert befinden sich beide Analyten durch Deprotonierung der Carboxylsäure-Gruppe in ihrem negativ geladenen Zustand. Eine Erhöhung der Ammoniumacetat-Konzentration von 10 mM auf 15 mM bei einem konstanten Anteil von 90% Acetonitril in der mobilen Phase führt bei 4-HB zu einer deutlichen Verstärkung ihrer Bindung auf die neutrale Diol-Säule und einer höheren Retentionszeit.

Zur Info: 2-HB beinhaltet eine intra-molekulare Wasserstoffbrückenbindung zwischen der Carboxyl- und der Hydroxyl-Gruppe [5], sodass sich dieses Molekül hier chromatographisch sehr „unpolar“ verhält (wie z. B. Toluol) und somit auf einer neutralen HILIC-Säule nicht retardiert wird.

Zurück zur polaren Trennung: Die eindeutig erhöhte Retention bei höherem Salzgehalt durch die dickere Wasserschicht ist für 4-HB vor allem bei neutralen Phasen deutlich zu sehen.

Der Einfluss der Salzkonzentration auf die Retention wird zusätzlich auf einen Aussalzeffekt zurückgeführt [1]. Dabei werden Wassermoleküle verstärkt zur Solvatation der Salzionen gebunden, wodurch die Solvatation der Analyten abnimmt und deren direkte Wechselwirkungen mit der stationären Phase begünstigt werden können. Im Fall der positiv geladenen Aminophase ist eine elektrostatische Anziehung mit beiden Molekülen zu erkennen, d. h. mit dem anionischen 2-HB und 4-HB (bei letzterem aufgrund der Hydrophilie wesentlich ausgeprägter). Eine Erhöhung der Salzkonzentration verursacht eine Abnahme der elektrostatischen Anziehung mit einer daraus resultierenden Abnahme in der Retention.

Wie bereits besprochen, führt bei zwitterionischen stationären Phasen die innenliegende kationische Gruppe zu einer elektrostatischen Anziehung negativ geladener Analyten wie 2-HB und 4-HB. Gleichzeitig erfahren diese Analyten eine elektrostatische Abstoßung durch die außenliegende anionische Gruppe der stationären Phase. Diese dominieren allerdings nicht, denn der Haupteffekt ist hier nicht die elektrostatische Wechselwirkung, sondern bevorzugt die erhöhte Dicke der Wasserschicht bei erhöhter Salzkonzentration.

In dem nächsten HILIC-Tipp werden wir uns den kombinierten Effekten von Organik und Salz zuwenden.

Literatur

[1] A.J. Alpert: Effect of salts on retention in hydrophilic interaction chromatography. Journal of Chromatography A 2018, 1538, 45-53

[2] G. Greco, S. Grosse, and T. Letzel: Study of the retention behavior in zwitterionic hydrophilic interaction chromatography of isomeric hydroxy- and aminobenzoic acids. Journal of Chromatography A 2012, 1235, 60-67.

[3] T. Letzel: Specifications of gradients in hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) In: Gradient HPLC for Practitioners: RP, LC-MS, Ion Analytics, Biochromatography, SFC, HILIC. Stavros Kromidas (ed) Wiley-VCH; ISBN-10: 352734408X;1st edition (17. April 2019), S. 175-182

[4] G. Greco and T. Letzel: Main interactions and influences of the chromatographic parameters in HILIC separations. Journal of Chromatographic Science, 2013, 51 (7), 684-693.

[5] S. Grosse and T. Letzel: Liquid chromatography / atmospheric pressure ionization mass spectrometry with post-column liquid mixing for the efficient determination of partially oxidized polycyclic aromatic hydrocarbons. Journal of Chromatography A 2007, 1139, 75-83.

Zu den anderen HILIC-Tipps

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Die Autoren

Dr. Thomas Letzel: Gründer und Geschäftsführer, Analytisches Forschungsinstitut für Non-Target Screening GmbH (AFIN-TS), www.afin-ts.de

Thomas Letzel wurde zum Chemielaboranten ausgebildet, studierte im Anschluss Chemie und promovierte in der Umweltanalytik. Danach erfolgten analytische Forschungsaufenthalte in Amsterdam und in München (an der TUM; wo er seit 2009 auch als Privatdozent „Analytische Chemie und Bioanalytik“ unterrichtet). Er forscht und berät seit 2018 (im Gründertrio) mit seinem eigenen Forschungsinstitut und hat es sich zur Aufgabe gemacht, HILIC als HPLC-Methode stärker in den analytischen Alltag zu holen.

Dr. Stefan Bieber: Gründer und Geschäftsführer, Analytisches Forschungsinstitut für Non-Target Screening GmbH (AFIN-TS)

Gemeinsam mit Thomas Letzel leitet Stefan Bieber die AFIN-TS GmbH als Geschäftsführer und beschäftigt sich seit vielen Jahren mit dem Non-Target Screening.

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Dr. Annette Dibowski: Geschäftsführerin, Dichrom GmbH, www.dichrom.com

Annette Dibowski ist nicht nur Geschäftsführerin von Dichrom und Sales Consultant bei Biotech Fluidics, sondern auch leidenschaftliche „Polarforscherin“ in der Chromatographie polarer Verbindungen.

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