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Wie beeinflusst hochreines Wasser die Datenqualität?

Hochpathogene Viren mittels Virus-Pseudotypen erforschen

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Material und Methoden

Zellkultur, Expressionsplasmide und Transfektion: HEK-293T, MDCKII und Vero E6-Zellen wurden in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium mit 10% fötalem Kälberserum und 1% Penicillin/Streptomycin-Lösung bei 37 °C und 5% CO2 inkubiert. Zur Subkultivierung und Aussaat wurden die Zellen mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS) gewaschen und mit Trypsin/EDTA-Lösung inkubiert.

Für die VSV-Pseudotypenherstellung wurden Plasmide zur Expression von folgenden viralen Hüllproteinen verwendet: VSV Glykoprotein (VSV G), Ebola-Virus Glykoprotein (EBOV GP), Spike Glykoprotein des Nahost-Atemwegssyndrom Coronavirus (MERS-CoV S), Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) des für die „Spanische Grippe“ verantwortlichen Influenza A-Virus (H1N1(1918)). Zusätzlich wurde ein Expressionsplasmid für die Dipeptidyl-Peptidase 4 (DPP4) verwendet. Leeres Expressionsplasmid diente als Kontrolle. Die Transfektion von HEK-293T-Zellen erfolgte mittels Calcium/Phosphat-Präzipitation, wobei sämtliche Puffer und Lösungen entweder mit vollentsalztem (VE-) Wasser oder mit Sartorius Arium pro VF-Reinstwasser hergestellt wurden.

Herstellung des Reinstwassers: Das eingesetzte Arium pro VF-Reinstwasser wurde wie bei Nitzki und Herbig (2013) [5] beschrieben aufbereitet. Es besitzt einen TOC-Gehalt (total organic carbon = gesamter organisch gebundener Kohlenstoff) von bis zu <2 ppb und eine Leitfähigkeit von 0,055 µS/cm (entspricht einem Widerstandswert von 18,2 MΩ x cm) kompensiert auf 25 °C.

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Produktion von VSV-Pseudotypen: Für die VSV-Pseudotypenherstellung wurde ein rekombinant hergestelltes VSV verwendet, welches nicht selbstständig replizieren kann, da in seinem Genom die Information für das VSV G durch Reportergene für ein grün-fluoreszierendes Protein (GFP) und eine Leuchtkäfer-Luziferase (fLUC) ersetzt wurde. Zur Vermehrung dieses Virus (VSV*∆G-fLUC) muss das VSV G in trans (z.B. mittels Transfektion eines Expressionsplasmids) bereitgestellt werden. Die VSV-Pseudotypenherstellung wurde wie bei Hoffmann et al. (2016) [6] beschrieben durchgeführt.

Vorbehandlung von Zielzellen mit Sialidase oder Inhibitoren: Zur Entfernung der terminalen Sialinsäuren von Glykoproteinen und -lipiden der Zellmembran, wurden MDCKII-Zellen mit 200 mU rekombinanter Sialidase behandelt. Um zu testen, ob der Hüllprotein-vermittelte Zell­eintritt von VSV-Pseudotypen abhängig von saurem pH und der Aktivität zellulärer Cysteinproteasen ist, wurden Vero E6-Zellen mit 50 nM Bafilomycin A1 oder 50 µM E-64d inkubiert. Die verwendeten Chemikalien wurden in Zellkulturmedium verdünnt, die Inkubation erfolgte für 2 h bei 37 °C und 5% CO2. Unbehandelte Zellen dienten als Kontrollen.

Untersuchung des Hüllprotein-vermittelten Zelleintritts: Zielzellen wurden für 1 h mit VSV-Pseudotypen inkubiert bevor sie mit PBS gewaschen und für 16 bis 20 h mit Zellkulturmedium weiter inkubiert wurden. Anschließend wurden die Zellen mit Luziferase-Aufschlusspuffer lysiert und die Luziferaseaktivität in Zelllysaten als Maßstab für die Effizienz des Hüllprotein-vermittelten Zelleintritts mithilfe kommerzieller Kits in einem Chemiluminometer gemessen.

Ergebnisse

Es ist bekannt, dass sich das Nahost-Atemwegssyndrom Coronavirus (Middle East respiratory syndrome coronavirus = MERS-CoV, ehemals humanes Coronavirus EMC = hCoV-EMC) durch die Interaktion des viralen Spike Glykoproteins (S) mit dem zellulären Membranprotein Dipeptidyl-Peptidase 4 (DPP4) an die Zelloberfläche anheftet und so nachfolgend den Zell­eintritt ermöglicht [7].

Zur Überprüfung, ob dies auch im Kontext von VSV-Pseudotypen zutrifft, wurden Zielzellen mit einem Expressionsvektor für DPP4 oder leerem Expressionsplasmid (kein Rezeptor) transfiziert. Wie erwartet, führte die gerichtete Expression von DPP4 zu einem signifikant verstärkten Zelleintritt von VSV-Pseudotypen, wenn diese das MERS-CoV S in ihrer Hülle trugen (s. Abb. 2A).

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Influenza A-Viren, die Auslöser von Grippeerkrankungen, benötigen für den Zelleintritt Zuckerstrukturen, so genannte Sialinsäuren, welche als natürliche Modifikationen auf zellulären Membranproteinen und Lipiden vorkommen (weiterführende Literatur [8]). Zur Überprüfung, ob der Einbau von Influenza A-Virus-Hüllproteinen in VSV-Pseudotypen ebenfalls zu einem Sialinsäure-abhängigen Zelleintritt führt, wurden VSV-Pseudotypen mit H1N1(1918) HA/NA verwendet und die Sialinsäuren auf der Zelloberfläche von Zielzellen enzymatisch entfernt. Erwartungsgemäß führte das Entfernen von Sialinsäuren zu einem drastisch verringerten Zelleintritt der VSV-Pseudotypen, die H1N1(1918) HA/NA in ihrer Hülle trugen (s. Abb. 2B). Dies beweist, dass Virus-Pseudotypen den Zell­eintritt von authentischen Influenza A-Viren korrekt dar­stellen.

Die Aktivierung des Ebola-Virus Glykoproteins während des Zelleintritts ist pH-Wert-abhängig und benötigt die Aktivität von Cysteinproteasen: Das Glykoprotein des Ebola-Virus (EBOV GP) ist hochgradig mit Zuckerstrukturen besetzt, welche das Virus vermutlich vor der effizienten Erkennung durch das menschliche Immunsystem schützen [9]. Während des Zell­eintritts muss jedoch der Teil des EBOV GP entfernt werden, der den Großteil der Zuckermodifikationen trägt [10]. Dies geschieht durch zelluläre Cysteinproteasen [11], die in endosomalen Vesikeln lokalisiert sind und nur bei dem dort vorherrschenden sauren pH-Wert aktiv sind. Im Folgenden wurde untersucht, ob der EBOV GP-vermittelte Eintritt von VSV-Pseudotypen ebenfalls von der Aktivität von zellulären Cysteinproteasen und einem sauren pH-Wert abhängt. Dazu wurden VSV-Pseudotypen hergestellt, welche das EBOV GP in ihrer Hülle trugen und nachfolgend auf Zielzellen beimpft, die zuvor mit Bafilomycin A1 (verhindert durch Blockade von Protonenpumpen die Ansäuerung innerhalb der Endosomen) oder einem Cysteinproteasen-Inhibitor (E-64d) inkubiert wurden. Hierdurch konnte gezeigt werden, dass der EBOV GP-vermittelte Zelleintritt auch im Kontext von VSV-Pseudotypen von einem sauren Milieu (s. Abb. 3A) und der Aktivität von Cysteinproteasen abhängig ist (s. Abb. 3B). Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die E-64d-Behandlung spezifisch den EBOV GP-getriebenen Zelleintritt blockiert, da VSV-Pseudotypen mit VSV G in ihrer Hülle zwar einen sauren pH-Wert für den Zell­eintritt benötigen, dieser Prozess aber unabhängig von Cysteinproteasen ist.

Der Reinheitsgrad des verwendeten Wassers beeinflusst die Qualität der VSV-Pseudotypen: Nachdem in den vorangegangenen Versuchen gezeigt werden konnte, dass VSV-Pseudotypen ein geeignetes Modell darstellen, um den Zell­eintritt von hochpathogenen Viren zu untersuchen, sollte nun geklärt werden, welchen Einfluss der Reinheitsgrad des verwendeten Wassers auf die Qualität der VSV-Pseudotypen hat. Während der Herstellung der VSV-Pseudotypen werden verschiedene Puffer und Lösungen verwendet, welche letztlich alle mit Wasser angesetzt wurden. Dabei ist zu beachten, dass Wasser nicht gleich Wasser ist, sondern für den Laborbedarf verschiedene Reinheitsstufen unterschieden werden. Um zu überprüfen, ob die Verwendung von Reinstwasser eine erhöhte Qualität der VSV-Pseudotypen bedeutet, wurden in einem Parallelexperiment zwei Chargen von VSV-Pseudotypen hergestellt: Eine Charge wurde unter der Berücksichtigung von VE-Wasser aus der zentralen Hauswasseranlage (Leitfähigkeit von 3,7-4,1 µS/cm bei 19 °C) als Grundlage für sämtliche Lösungen und Puffer hergestellt, während eine weitere Charge mit Lösungen und Puffer auf Basis von Arium pro VF-Reinstwasser (Leitfähigkeit 0,055 µS/cm kompensiert auf 25 °C) generiert wurde. Als Hüllproteine wurden das EBOV GP sowie das MERS- CoV S untersucht. Nach der parallelen Herstellung der VSV-Pseudotypen unter Einhaltung identischer Inkubationsbedingungen wurden Zielzellen beimpft und der Hüllprotein-vermittelte Zelleintritt der VSV-Pseudotypen quantifiziert. Damit konnte gezeigt werden, dass der Zelleintritt (als Parameter für das Qualitätsmaß) der VSV-Pseudotypen, welche unter Verwendung von Arium pro VF-Reinstwasser als Grundlage aller Puffer und Lösungen hergestellt wurden, signifikant höher war gegenüber Pseudotypen, bei deren Herstellung VE-Wasser verwendet wurde (s. Abb. 4).

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