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Mykotoxine

Keine Chance für Mykotoxine

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Besonderes Augenmerk legten Dr. Cabrices und Kollegen auf eine möglichst effiziente Probenvorbereitung. „Wer auf einen optimalen Einsatz von Personal und Technik Wert legt, kommt an der Automatisierung manuell aufwändiger Arbeitsschritte nicht vorbei“, bringt es der Applikationsexperte auf den Punkt. Dieses Ziel vor Augen entwickelten und realisierten Dr. Cabrices und Kollegen ihre Multimykotoxinmethode unter Einsatz eines Gerstel-Multi-Purpose-Samplers (MPS XL), der dazu taugt, die zahlreichen erforderlichen Probenvorbereitungsschritte adäquat zu automatisieren.

Der MPS verfügt über zwei Türme, etwa zum reibungslosen Handling unterschiedlich großer Lösemittelvolumen, und wurde mit unterschiedlichen Werkzeugen ausgestattet, u.a. mit einer Doppelpositionszentrifuge (CF-100), einer dispersiven Festphasenextraktion, namentlich der Disposable Pipette Extraction (DPX), sowie der Option, Lösungen und Eluat vortexen und einengen zu können.

Die Probenvorbereitung im Fokus

Die Trennung der Analyten erfolgte mit einem HPLC-System Agilent 1200 Serie auf folgender Säule: Phenomenex-Gemini-Säule 5 µm, 110 Å, 150 x 4,6 mm, unter Verwendung eines Lösemittelgradienten; bei der mobilen Phase handelte es sich um ein Gemisch aus Methanol, Wasser und Essigsäure (89:10:1 bis 97:2:1) mit 5 mM Ammoniumacetat. Die mehrdimensionale massenselektive Detektion geschah auf einen Qtrap 4500-MS-System von AB Sciex.

Die einzige manuell auszuführende Tätigkeit im Rahmen ihrer Methode sei, wie Dr. Cabrices nach erfolgreichem Abschluss der Methodenentwicklung berichtet, das Einwiegen von einem Gramm der homogenisierten, im vorliegenden Fall Getreideprobe in ein 10-mL-Vial, das verschlossen und auf dem Probenteller des MPS platziert wird. Alle weiteren Schritte übernimmt der MPS softwaregesteuert. Dazu gehöre die Zugabe von 4 mL einer Acetonitril-Wasser-Mischung (84:16) in das Vial; Transport des Vials zum Agitator; Durchmischen (1 h, 55 °C, 500 umin–1), Zentrifugieren. Vom Überstand werden dann 500 µL für die nachfolgende DPX entnommen.

Automatisierungsgrad maximieren

„Die DPX spielt für die Aufreinigung des Probenextraktes und damit für die gesamte Probenvorbereitung eine zentrale Rolle“, wie Dr. Cabrices erklärt. Die DPX wurde von Dr. William E. Brewer an der University of South Carolina entwickelt, 2001 zum Patent angemeldet und von Gerstel auf dem MPS-Autosampler automatisiert: „Während bei der klassischen Festphasenextraktion die Festphase in Form einer gepackten Säule vorliegt“, beschreibt Dr. Cabrices, „ist die Festphase im Fall der DPX innerhalb einer Pipettenspitze frei beweglich.“ Der Stoffaustausch zwischen der festen Phase, im vorliegenden Fall handelte es sich um DPX-Myco bzw. DPX-Wax, mit der flüssigen Probe werde um ein Vielfaches beschleunigt, zudem sei das benötigte Probenvolumen deutlich geringer. Die Extraktionsleistung hänge auch eher von der Zeit ab, in der Lösungen und Sorbens ins Gleichgewicht kommen, als von Durchflussraten durch ein gepacktes Bett.“ Und während klassische SPE-Kartuschen verstopfen können, betont Dr. Cabrices weitere Vorzüge der DPX, ließen sich mittels DPX selbst feststoffhaltige oder viskose Proben störungsfrei abarbeiten.

Sobald die DPX abgeschlossen ist, überführt der MPS 200 µL des aufgereingten Extraktes in ein vorbereitetes 2-mL-Vial; das Eluat wird in der mVAP-Station des MPS eingedampft und der Rückstand in 500 µL des LC-Laufmittels wieder aufgenommen. Das resultierende Eluat dient der unmittelbar nachfolgenden HPLC-MS/MS-Bestimmung von Mykotoxinen.

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