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Analyse biogener VOCs per GC/MS

Kinderwunsch: Der Duft der Frauen und was er über ihre Fruchtbarkeit verrät

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Blick auf die verschiedenen analytischen Schritte

Zur Entwicklung einer ersten Datenbasis sammelte Ong über 28 Tage täglich Urinproben von zehn Frauen im Alter von 18 bis 28 Jahren unterschiedlicher Herkunft; keine der Probandinnen nahm die Pille oder andere Medikamente, die das Hormongleichgewicht hätten stören und die Analysenresultate verfälschen können. Ziel war es, die flüchtigen Verbindungen, die mit den Sexualhormonen korrelieren, im Verlauf eines ganzen Menstruationszyklus zu monitoren. Vor der Probennahme (Mittelstrahlurin), die unter maximal sterilen Bedingungen erfolgte, durften die Frauen zwei Stunden lang keine Nahrung zu sich nehmen. Die Proben wurden innerhalb von vier Stunden nach der Probennahme aliquotiert und in tiefkühltauglichen Vials bei -80 °C gelagert.

Abb 2: Detail eines GC/MS-Systems mit Gerstel-Multi-Purpose-Sampler (MPS), wie in der beschriebenen Metabolismus-Studie verwendet.
Abb 2: Detail eines GC/MS-Systems mit Gerstel-Multi-Purpose-Sampler (MPS), wie in der beschriebenen Metabolismus-Studie verwendet.
(Bild: Gerstel)

Um Kontaminationen zu vermeiden, die das Ergebnis der Messung hätten beeinträchtigen oder verfälschen können, verwendete Ong für die Analyse VOC-freie mit PTFE/Silikon-Kappen verschlossene 10-mL-Vials, die zuvor getrennt zwölf Stunden bei 100 °C gelagert wurden, um den VOC-Hintergrund zu reduzieren. Etwa eine Stunde vor der Analyse wurden sie auf Raumtemperatur gebracht und mit einem Milliliter der kurz zuvor gemixten Probe beschickt. Die Vials wurden verschlossen und auf dem gekühlten Probenteller des verwendeten Analysenroboters (Gerstel-Multi-Purpose-Sampler, MPS) bei 4 °C bis zur Analyse aufbewahrt. Bei 60 °C wurden die Urinproben dann fünf Minuten lang mit 250 U/min geschüttelt und inkubiert. Die Extraktion der flüchtigen Metaboliten aus dem Dampfraum über der Probe erfolgte mittels SPME unter Verwendung einer mit 30/50-µm-DVB/CAR/PDMS beschichteten Faser. Vor jeder Probenextraktion wurde die Faser zehn Minuten lang bei 270 °C ausgeheizt. Extrahiert wurde bei 60 °C für die Dauer von 60 Minuten, wobei die Probe gleichzeitig mit 250 U/min geschüttelt wurde. Anschließend wurde die Faser für fünf Minuten bei 250 °C im GC-Eingang positioniert und Analyten auf die GC-Säule überführt. Sämtliche Schritte der Probenvorbereitung bis zur Probenaufgabe wurden vom MPS automatisiert ausgeführt.

Ong führte die Trennung der Analyten unter Einsatz eines zweidimensionalen Säulensatzes (GCxGC; Restek) aus (Säule 1: Rxi-624Sil MS [60 m x 250 µm x 1,4 µm], Säule 2: Stabilwax [1 m x 250 µm x 0,5 µm]). Die Säulen wurden unabhängig voneinander aufgeheizt. Das Temperaturprogramm von Säule 1 gestaltete sich wie folgt: 50 °C (2 min) – 5 °C/min – 225 °C (2 min) – 30 °C/min – 230 °C (30 min); Säule 2: Die zweite Säule wurde mit einer Verschiebung von 5 °C relativ zum Primärofen aufgeheizt. Die Detektion erfolgte mit einem Time-of-Flight-Massenspektrometer (TOF-MS/MS). Ein Quad-Jet-Modulator wurde mit 2-s-Modulationsperioden (0,5 s heiße und 0,5 s kalte Pulse) verwendet und einem 15 °C-Versatz relativ zum Sekundärofen. Als Trägergas wurde Helium mit einem Fluss von 2 mL/min eingesetzt. Die Massenspektren wurden erfasst bei 100 Hz über einen Bereich von m/z = 35 bis 550. Die Datenerfassung erfolgte mit der Chroma-TOF-Software (Leco), berichtet Ong.

Gute Resultate und eine Basis für weitere Forschung

Die oben beschriebenen Methodenparameter insbesondere hinsichtlich des eingesetzten Probenvolumens und der Extraktionsdauer hat Ong nach eigenen Angaben vor Beginn der eigentlichen Messung optimiert. Die Methode wurde von ihr täglich kalibriert. Insgesamt identifizierte Ong im Urin der Probandinnen 935 unterschiedliche Analyten. Darunter waren zehn Verbindungen, die sich im Urin aller Probandinnen befunden haben und die sich nach entsprechender statistischer Auswertung als Schlüsselanalyten für den weiblichen Menstruationszyklus bezeichnen lassen.

Namentlich handelt es sich unter anderem um O-Cymen, 4,7-Dimethybenzofuran, 3-Octen-2-on, Butylcyclobutan, 2,2-Dimethylbutanal sowie 2-Hexylfuran, die insbesondere in der fruchtbaren Zeit einen deutlichen Anstieg gezeigt haben und damit potenziell als Biomarker für die Fruchtbarkeit der Frau herangezogen werden können bzw. die eine statistische Signifikanz zeigen in Korrelation zu hormonellen Veränderungen, schreibt Ong. Künftig sollen die zehn Schlüsselverbindungen bei der Untersuchung unabhängiger Datensätze validiert und auf ihre Robustheit untersucht werden.

Literatur:

[1] Janek S. Lobmaier, Urs Fischbacher, Urs Wirthmüller, Daria Knoch: The scent of attractiveness: Levels of reproductive hormones explain individual differences in women’s body odour. Proceedings of the Royal Society B, 12. September 2018, doi:10.1098/rspb.2018.1520, http://rspb.royalsocietypublishing.org/lookup/doi/10.1098/rspb.2018.1520

[2] Stephanie Marie Ong, Comprehensive Analysis of Volatile Biomarkers for Female Fertility, Arizona State University, May 2018, https://repository.asu.edu/attachments/201413/content/Ong_asu_0010N_17996.pdf

[3] Guido Deußing, Automatisierte Massenanalyse – Epidemiologische Probensätze auf dem Prüfstand, Laborpraxis 9 (2016) 64-66, www.laborpraxis.vogel.de/epidemiologische-probensaetze-auf-dem-pruefstand-a-550970/

* G. Deußing: Redaktionsbüro Guido Deußing, 41464 Neuss

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