Ladungsvarianten von Biopharmazeutika sicher charakterisieren

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Trennung: Vergleich von Salz- und pH-Gradienten

Traditionell wurde die Proteintrennung gewöhnlich mithilfe von Salzgradienten durchgeführt. Eines der Hauptprobleme beim Verwenden von Salzgradienten ist, dass für jedes einzelne Zielproteinmolekül ein individueller Gradient entwickelt werden muss. Darüber hinaus hatte die Empfindlichkeit von Salzgradienten gegenüber genauen Ionenkonzentrationen einschließlich des Proteins selbst zur Folge, dass zum Erreichen einer akzeptablen Wiederholbarkeit lange Säulen und flache Salzgradienten erforderlich waren. Dementsprechend war es um die Wiederholbarkeit und Robustheit bei schnellen Verfahren häufig schlecht bestellt, einschließlich der zeitraubenden Verfahrensentwicklung, die für jedes Kandidatenmolekül wiederholt werden musste.

2009 veröffentlichte Genentech zum ersten Mal die Verwendung von pH-Gradienten anstelle von Salzgradienten zum Trennen von Ladungsvarianten. Der Vorteil pH-basierter Gradienten liegt darin, dass diese Methode weltweit auf jeden beliebigen mAb anwendbar ist und somit das Entwicklungsverfahren erheblich vereinfacht. Es wurde festgestellt, dass mAbs mit isoelektrischen Punkten im Bereich von ungefähr 7 bis 9 mithilfe von Kationenaustauschersäulen, die im pH-basierten Elutionsmodus betrieben werden, ausgezeichnet getrennt werden können. Damit bot sich ein universellerer Ansatz, der eine einzige Methode zum problemlosen Trennen unterschiedlicher Ladungsvarianten in einem Bereich von Antikörpern bot. Auch die Analysedauer konnte durch das Verwenden von pH-Gradienten anstelle von herkömmlichen Salzgradienten mit Ionenstärke erheblich verringert werden (von 90 Minuten auf fünf bis 20 Minuten).

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Der Vergleich der Elutionsreihenfolgen der Versuche mit salz- und pH-basierten Gradienten hat gezeigt, dass die mAb-Varianten unter beiderlei Rahmenbedingungen gewöhnlich in ähnlicher Reihenfolge eluiert werden (s. Abb. 2). Normalerweise sorgen jedoch pH-Gradienten für eine bessere Auflösung von mAb-Varianten (s. Abb. 3).

Verbesserte mAb-Trennung mit generischen Plattformverfahren

Bei der Verfahrensoptimierung für salzbasierte Gradienten wurde normalerweise die im Folgenden dargestellte Vorgehensweise eingehalten (s. LP-Tipp: Entwicklungsprozess 1). Häufig wird zusätzlicher Arbeitsaufwand erforderlich, um das Salzgradienten-Verfahren auf die einzelnen Ladungsvarianten abzustimmen. Ein ausreichend optimierter Salzgradient bietet zwar eine hervorragende Leistung, Spitzenkapazität und Auflösung, das Optimieren und Übertragen der Verfahren bindet jedoch Ressourcen. Dies gilt insbesondere für in der Auftragsforschung tätige Unternehmen, die derartige Analysen für mehrere Kunden an Dutzenden von ähnlichen mAbs durchführen.

Mit pH-Gradientenpuffern und Kits, wie dem in Abbildung 2 verwendeten pH-Gradientenpuffer-Kit CX-1 von Thermo Scientific, lassen sich mithilfe der Kationenaustauschchromatographie weitgehend reproduzierbare, lineare pH-Gradienten entwickeln. Dieses universell einsetzbare LC-basierte Plattformverfahren spart Zeit und ermöglicht die Verfahrensübertragung zur Qualitätssicherung und -kontrolle für ein umfangreiches Spektrum an mAb-Ladungsvarianten. Im Gegensatz zu herkömmlichen Salzgradienten lässt sich der PI aufgrund der Retentionszeit der Ladungsvarianten und einem schmalen pH-Bereich prognostizieren, um Trennungen mit hoher Auflösung zu gewährleisten.

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