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Ionenaustauschchromatographie

Ladungsvarianten von Biopharmazeutika sicher charakterisieren

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Die Bausteine der pH-Gradientenpuffer-Plattform CX-1 sind zwei aus mehreren Komponenten bestehende zwitterionische Pufferkonzentrate, die mithilfe einer patentierten Formulierung hergestellt werden. Pufferlösung A ist bei pH 5,6 titriert, Pufferlösung B bei pH 10,2. Als Pufferlösung kommen zwitterionische und daher in diesem pH-Bereich neutrale „Good“-Puffer zum Einsatz; diese werden daher von der stationären Phase der Kationenaustauschersäule nicht gebunden.

Für die pH-Gradienten-Pufferanalyse kann ein linearer Gradient von pH 5,6 bis pH 10,2 mithilfe eines linearen Pumpengradienten von 100% Puffer A (pH 5,6) zu 100% Puffer B (pH 10,2) generiert werden; hierdurch wird die Analyse der mAb-Ladungsvarianten universell anwendbar und zum Verbessern der Trennleistung problemlos optimierbar, wodurch sich ein besseres Trennverfahren für Ladungsvarianten ergibt als beim Salzgradienten-Verfahren (s. Abb. 3). Die hier beschriebenen Methoden wurden bereits für die Entwicklung von Biosimilaren im Vergleich zu einigen der meistverkauften mAbs vorgestellt (s. LP-Tipp: Entwicklungsprozess 2).

Ergänzendes zum Thema
LP-Tipp – Entwicklungsprozess 2

Entwicklungsprozess 2 – pH-Gradienten-Verfahren für mAb – zwei Stunden.

1. Vorbereitung (fünf Minuten):

  • Herstellen einer 1:10 Verdünnung des pH-Gradientenpuffer-Kits CX-1.

2. Ermitteln des Elutionsprofils mithilfe des Plattform-pH-Gradienten-Verfahrens (30 Minuten):

  • Verwenden des Standard-Plattformgradienten für mAb, 0 bis 100% B.

3. Optimieren für Geschwindigkeit und Trennung (90 Minuten):

  • Verwenden eines flacheren pH-Gradienten über einen enger gefassten pH-Bereich zum Eluieren der Varianten. Das chromatographische Profil und somit die Elutionsreihenfolge der Varianten bleibt weiterhin prognostizierbar, wenn ein flacherer pH-Gradient verwendet wird. Gewöhnlich sind hierzu je nach Protein fünf Durchläufe von jeweils zehn bis 20 Minuten erforderlich.

Es kann schnell gehen oder auch ultraschnell

Die Verfahrensoptimierung mithilfe von pH-Gradientenpuffern ist schnell und erfordert häufig nur wenige Stunden. Die Kombination mehrerer neuer Techno­logien in einem einzigen Arbeitsablauf hat es Wissenschaftlern ermöglicht, den Maßstab für das schnelle, sichere Charakterisieren von Ladungsvarianten höher anzusetzen [7]: Die dargestellte ultraschnelle Trennung von Ladungsvarianten (s. Abb. 4) wird aufgrund mehrerer Fortschritte bei den Chromatographieverfahren möglich.

Bildergalerie

Der Mechanismus der pH-Gradienten-Chromatographie an sich trägt zum Einsatz kürzerer, schnellerer Säulen mit geringeren Teilchengrößen bei. Die hier verwendeten handelsüblichen Puffer erzeugen einen linearen Gradienten, der eine intelligente Verfahrensoptimierung ermöglicht. Und schließlich ermöglichen UHPLC-Weiterentwicklungen außerordentlich geringe Totvolumen, eine hochpräzise Gradientenbildung und einen absolut inerten Flusspfad; aus diesen Vorteilen ergibt sich ein lückenloser Analysezyklus im Bereich von zwei Minuten, einschließlich erneuter Säulenäquilibrierung und Injektionszeit, wodurch der Benutzer im 48-stündigen Dauerbetrieb mehr als 1400 Proben bearbeiten kann.

Danksagungen: Die Autoren möchten Amy Farrell, Craig Jakes, Stefan Mittermayr, Silvia Millan Martin und Jonathan Bones vom National Institute for Bioprocessing Research and Training (NIBRT), Dublin/Irland für ihre freundliche Bereitstellung einiger der in diesem Artikel verwendeten Daten und Praktiken danken. Weiterer Dank geht außerdem an Shanhua Lin, Chris Pohl, Manish Singh, Sachin Pandey und Mauro De Pra von Thermo Fisher Scientific für die hier präsentierten Anwendungen und Daten.

Referenzen:

[1] www.ich.org/products/guidelines/quality/article/quality-guidelines.html

[2] Thermo Scientific Apps Lab – 3734 – Charge Variant Analysis of NIST mAb

[3] Farnan, D., and Moreno, G., Anal. Chem., 2009, 81 (21), pp 8846–8857

[4] Thermo Scientific Application Note 21565 - The advantage of pH gradient buffers is demonstrated by the ion exchange separation of charge variants of denosumab

[5] www.thermofisher.com/chargevariants

[6] Thermo Scientific Application Note 21092 - High-Resolution Charge Variant Analysis for Top-Selling Monoclonal Antibody Therapeutics Using a Linear pH Gradient Separation Platform

[7] Thermo Scientific Technical Note 160 - Development of Ultra-fast pH-Gradient Ion Exchange Chromatography for the Separation of Monoclonal Antibody Charge Variants

* Dr. K. D’Silva, K. Cook: Thermo Fisher Scientific, Hemel Hempstead/UK

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