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Bessere Bilder durch neuen Detektor

Laser-Scanning-Mikroskopie – Keine Kompromisse nötig

| Autor / Redakteur: Joseph Huff* und Annette Bergter** / Marc Platthaus

Abb.3: Anwendungsbeispiel für eine Resonanzscanning-Zeitserie im Vergleich zur Zeitserie mit Airyscan-Fast-Aufnahmemodus, bei dem Kardiomyozyten mit Tubulin-EMTB verwendet werden, um die Deformierung von Mikrotubuli bei hohen Bildraten zu messen. (Bilder oben) Standbilder aus einer Resonanzscanning-Zeitserie, die mit 80 Bildern/Sekunde erfasst wurde. (Bilder unten) Standbilder aus einer Zeitserie im Airyscan Fast-Modus, die mit 96 Bildern/Sekunde aufgenommen wurden. Jede Zeitserie zeigt jeweils die ruhenden Tubuli, kontrahierte Tubuli und wieder ruhende Tubuli.
Abb.3: Anwendungsbeispiel für eine Resonanzscanning-Zeitserie im Vergleich zur Zeitserie mit Airyscan-Fast-Aufnahmemodus, bei dem Kardiomyozyten mit Tubulin-EMTB verwendet werden, um die Deformierung von Mikrotubuli bei hohen Bildraten zu messen. (Bilder oben) Standbilder aus einer Resonanzscanning-Zeitserie, die mit 80 Bildern/Sekunde erfasst wurde. (Bilder unten) Standbilder aus einer Zeitserie im Airyscan Fast-Modus, die mit 96 Bildern/Sekunde aufgenommen wurden. Jede Zeitserie zeigt jeweils die ruhenden Tubuli, kontrahierte Tubuli und wieder ruhende Tubuli. (Bild: Ben Prosser, University of Pennsylvania [3])

Ein neues Beleuchtungs- und Detektionskonzept für Laser-Scanning-Mikroskopie (LSM) bietet im Vergleich zum herkömmlichen LSM-Imaging sowohl eine höhere Auflösung als auch ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis (SRV) in Kombination mit gesteigerten Aufnahmegeschwindigkeiten. Lesen Sie, wie dies technisch realisiert wird.

Das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop (LSM) hat sich in der biomedizinischen Forschung zu einem der beliebtesten Instrumente für Fluoreszenzabbildungs-Aufgaben entwickelt. LSM erfreut sich hauptsächlich deshalb so großer Beliebtheit, weil Forscher kontrastreiche Bilder und vielseitig optische Schnitte erstellen und so dreidimensionale biologische Strukturen [1] untersuchen können. Die Erstellung von optischen Schnitten durch das LSM erfolgt, indem ein fokussierter Laserpunkt beugungsbegrenzt über eine Probe geführt und Punkt für Punkt ein Bild erzeugt wird. Normalerweise wird das für jeden Punkt erzeugte Fluoreszenzlicht erfasst und durch eine Öffnung (Pinhole) auf einen nicht ortsauflösenden Detektor (typischerweise einen PMT-Detektor) zurückfokussiert. Beim traditionellen Detektionskonzept unterdrückt das Pinhole nicht fokussiertes Licht, der PMT-Detektor wandelt das verbleibende Licht aus der Fokusebene in ein digitales Signal um und erzeugt das Bild eines optischen Schnittes [2].

Das Video zeigt die Aufnahme eines Drosophila-Melanogaster-Embryos mit dem LSM 880

Bei Konfokalsystemen konzentrierten sich in den letzten 25 Jahren die wichtigsten Entwicklungen von handelsüblichen Systemen auf neuartige Methoden, die den Bildkontrast, die Vielseitigkeit des Instruments und die Aufnahmegeschwindigkeit verbesserten. Heutige LSMs verfügen über die Flexibilität, die für viele Anwendungsbereiche in der Forschung notwendig ist. Sie liefern Daten zur Zelldifferenzierung, Cell tracking (Zellverfolgung) und dynamische Prozesse lebender Zellen, zur Expression und Lokalisierung von Proteinen, zu neuralen Netzwerkverbindungen, zur Gewebestruktur, Genexpression und Protein-/Genfunktion (um nur einige zu nennen). Trotzdem mussten Forscher bis zur Einführung des Airyscan-Detektionskonzepts beim LSM-System innerhalb der Leistungsmerkmale immer wieder Abstriche machen (d.h. entweder höhere Geschwindigkeit oder höhere Auflösung, höhere Auflösung oder besseres Signal-Rausch-Verhältnis usw.), um Anwendungsanforderungen erfüllen zu können. Mit der Einführung des Airyscan-Detektionskonzepts im Jahr 2014 und dem neuen Airyscan-Fast-Modus gehören diese Kompromisse des herkömmlichen Imaging der Vergangenheit an, da jetzt alle Messfunktionen simultan verbessert werden können.

Höhere Auflösung und besseres Signal-Rausch-Verhältnis

Das Airyscan-Detektordesign verbessert gleichzeitig das SRV und die Auflösung mithilfe eines hexagonal angeordneten GaAsP-PMT-Arrays mit 32 Kanälen, das in der Pinhole-Ebene liegt (s. Abb. 1) und das herkömmliche Pinhole-PMT-Konzept ersetzt. Dieses Konzept kombiniert zwei bevorzugte, aber einander widersprüchliche Einstellungen des Pinhole im herkömmlichen LSM: Ein offenes Pinhole lässt viel Licht passieren und erhöht dadurch das Signal-Rausch-Verhältnis; eine kleine Pinhole-Öffnung verbessert aber die Auflösung des Systems. Dabei verhält sich jedes der 32 Detektorelemente wie ein kleines unabhängiges Pinhole, bei dem nicht nur die optische Auflösung verbessert, sondern auch die räumliche Verteilung des Lichts erfasst wird.

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