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Mikrodissektion Mikrodissektion von Einzelzellen und On-Chip-Analyse

Autor / Redakteur: Sigrid Schlieben*, Renate Burgemeister* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Zahlreiche Applikationen in Biologie und Medizin erfordern die molekulargenetische Analyse definierter Einzelzellen. Die Kombination der Mikrodissektion von Carl Zeiss mit der AmpliGrid-Technologie von Advalytix erlaubt jetzt die berührungslose Selektion von Einzelzellen mit direkter On-Chip-Analyse.

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Abb. 1: Das Mikrodissektionssystem PALM MicroBeam von Carl Zeiss.
Abb. 1: Das Mikrodissektionssystem PALM MicroBeam von Carl Zeiss.
( Bild: Carl Zeiss MicroImaging )

Die molekulargenetische Analyse definierter Einzelzellen spielt bei einer Vielzahl von Applikationen eine entscheidende Rolle. Dabei gilt es zwei Herausforderungen zu bewältigen: Zum einen müssen Einzelzellen kontaminationsfrei isoliert werden. Zum anderen muss die Analyse dieser Einzelzellen in einem extrem kleinen Reaktionsvolumen stattfinden, um zu einem zuverlässigen Ergebnis zu kommen. Aufgrund technischer Restriktionen war bisher nur die Analyse von Zellpools möglich, die im ungünstigsten Fall eine Mischpopulation darstellten. Die daraus gewonnenen Ergebnisse repräsentierten daher immer Durchschnittswerte.

Berührungslose Laser-Mikrodissektion von Einzelzellen

Die Kombination der berührungslosen Laser Capture Microdissection (LCM) von Carl Zeiss mit der Low-Volume On-Chip-Technologie von Advalytix wird jetzt beiden Anforderungen in einem Ansatz gerecht.

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Die Mikrodissektion von Carl Zeiss erlaubt die präzise Isolierung von „tatsächlichen“ Einzelzellen aus Gewebeproben, beispielsweise von Pathologie-Präparaten. Ebenso können aber auch lebende Einzelzellen aus der Zellkultur isoliert werden. Da sowohl Ausschneiden als auch Transfer der Zelle auf den Glaschip ausschließlich durch Laserlicht und daher vollkommen berührungslos erfolgen, wird ein Kontaminationsrisiko ausgeschlossen.

On-Chip-Analyse und Kombination beider Technologien

Der spezielle Objektträger von Advalytix wird durch einen lithographischen Prozess so modifiziert, dass 48 hydrophile Reaktionsflächen entstehen. Diese Reaktionsflächen ermöglichen die gleichzeitige Analyse von 48 Einzelzellen.

Bei der Kombination beider Technologien wird die einzelne Zelle berührungslos mittels Laser-Mikrodissektion direkt auf den Objektträger transportiert. Pipettier-, Aufreinigungs- und Transferverluste sind damit ebenso ausgeschlossen wie ein Verlust der Zelle auf dem Weg von Mikrodissektion, optischer Inspektion und molekulargenetischer Analyse. Die Verringerung des Reaktionsvolumens für die nachfolgende Reaktion auf einen Mikroliter bewirkt eine Konzentration der Probe. Das kann bei limitierten Ausgangsmaterialien, beispielsweise forensischen Spuren, von entscheidender Bedeutung sein. Daneben lassen sich auf diese Weise Chemikalien einsparen.

Das Mikrodissektionssystem von Carl Zeiss, ist mit einem speziellen Halter für den Advalytix-Objektträger ausgestattet, der gewährleistet, dass alle Einzelzellen treffsicher auf die gewünschte Reaktionsfläche gelangen. Verschiedene Software-Module erlauben daneben sowohl eine Automatisierung der Zellerkennung als auch der nachfolgenden Mikrodissektion. Somit kann der komplette Workflow von der Gewinnung der Zelle bis zur Sequenzanalyse automatisiert ablaufen.

DNA-Analyse von Einzelzellen in Rechtsmedizin und Onkologie

Die Analyse von DNA ist für zahlreiche Applikationen von Bedeutung. So weitet die Rechtsmedizin DNA-Analysen zur Verbrechensbekämpfung immer mehr aus. In der Onkologie werden dagegen im Blut zirkulierende Tumorzellen für Minimal-Residual-Disease-Studien (MRD, minimale Rest-erkrankung) analysiert. Gemeinsam ist diesen Applikationen das oft limitierte Ausgangsmaterial, welches in der Regel in nicht reiner Form vorliegt, sondern beispielsweise als Gemisch von Täter/Opfer oder Tumorzelle/gesunde Zelle.

Der erste Schritt der Analyse besteht daher in der Selektion der gewünschten Zellen aus dem Zellgemisch. Diese sollten absolut kontaminationsfrei sein, um ein eindeutiges genetisches Profil des Täters oder der Tumorzelle erstellen zu können. Diesen Anforderungen wird die berührungslose Mikrodissektion mit dem Zeiss-System gerecht.

Im zweiten Schritt der Analyse müssen aus dieser einzelnen, selektierten Zelle die darin vorhandenen Moleküle nachgewiesen werden. Das erfordert ein hochsensitives System, das in einem möglichst kleinen Reaktionsansatz arbeitet. Dazu wird zu der Zelle auf dem Objektträger direkt der Reaktionsansatz für die Amplifikation gegeben. Der Reaktionsansatz wird mit Öl überschichtet und anschließend wird ohne weitere Pipettierschritte die STR-Typisierung auf einem Eppendorf Mastercycler mit in situ-Adapter durchgeführt (STR, Short Tandem Repeat). Als STR-Typisierungssystem bietet sich z.B. das Powerplex-16-System von Promega an. Die anschließende Sequenzanalyse der PCR-Produkte mittels Kapillarelektrophorese zeigt auswertbare Profile von Einzelzellen.

* Dr. S. Schlieben, Dr. R. Burgemeister, Carl Zeiss MicroImaging, 81379 München,

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