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SPEKTROSKOPIE/PHOTOMETRIE NIR-Methodentransfer leicht gemacht

| Autor / Redakteur: HANS-HERMANN BELZ* / Gerd Kielburger

Die Nah-Infrarot-(NIR-)Spektroskopie hat sich in den letzten Jahren zu einer effizienten Methode entwickelt, um ein hohes Probenaufkommen, wie es zum Beispiel bei der Einzelgebindeprüfung in der pharmazeutischen Industrie vorkommt, auf einfachem Wege routinemäßig zu bewältigen.

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Abb.1: Der Nicolet Antaris FT-NIR Analysator, der eine erfolgreiche Methodenübertragung durch sein Messzubehör erlaubt, in das der Detektor fest installiert ist.
Abb.1: Der Nicolet Antaris FT-NIR Analysator, der eine erfolgreiche Methodenübertragung durch sein Messzubehör erlaubt, in das der Detektor fest installiert ist.
( Archiv: Vogel Business Media )

Die Nah-Infrarot-(NIR-)Spektroskopie hat sich in den letzten Jahren zu einer effizienten Methode entwickelt, um ein hohes Probenaufkommen, wie es zum Beispiel bei der Einzelgebindeprüfung in der pharmazeutischen Industrie vorkommt, auf einfachem Wege routinemäßig zu bewältigen. Die Einsatzgebiete für diese Methode sind aber auch im gesamten Produktionsprozess zu finden, von der Identitätsprüfung im Wareneingang über die Kontrolle der Zwischenprodukte bis zur Abnahme der fertigen Produkte am Ende der Produktionskette. Der Einsatz von Fourier Transform-(FT-NIR-)Spektrometer hat in diesem Spektralbereich zusätzlich deutliche Vorteile bezüglich spektraler Auflösung und Reproduzierbarkeit gebracht.

Die Auswertung von NIR-Spektren erfordert wegen der starken Überlagerung der Absorptionsbanden komplexe Rechenalgorithmen, die mit dem allgemeinen Stichwort „Chemometrie“ beschrieben werden. Diese Methoden arbeiten auf der Grundlage statistischer Verfahren. Für die Entwicklung muss deshalb eine relativ große Zahl von Referenzstandards zur Verfügung stehen. Wenn beabsichtigt ist, mit mehreren Systemen an verschiedenen Orten die gleichen Analysen durchzugeführen, sollte sichergestellt sein, dass nicht an jedem einzelnen System die Kalibrierung neu durchgeführt werden muss. Ansonsten würden sich die Vorteile der Methode stark relativieren. Für eine erfolgreiche Methodenübertragung ist vor allem das Konstruktionsprinzip des NIR-Spektrometers wichtig. Alle Komponenten, die zu abweichenden Messwerten führen können, müssen für eine hohe Reproduzierbarkeit entwickelt und mit minimalen Toleranzen hergestellt werden.

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FT-NIR Spektrometer sind besonders dafür geeignet, weil sie mit wenigen optischen Komponenten auskommen und die Datenaufnahme mittels eines HeNe-Referenz-Lasers gesteuert wird. Eine prinzipielle Unsicherheit kann aber noch im verwendeten Messzubehör liegen, wenn es für verschiedene Anwendungen gewechselt werden muss (Transmission Integrating Sphere, Glasfaser-Optik, etc.). Der Nicolet Antaris FT-NIR Analysator von Thermo Electron umgeht diese Schwierigkeit, weil jedes einzelne Messzubehör mit seinem eigenen Detektor fest installiert ist.

Zusätzlich hat jedes dieser Module eine eigene Vorrichtung zur Messung des Referenzsignals („Background“). Die einzelnen Komponenten des Analysators sind sehr stabil konstruiert und werden mit sehr engen Toleranzen gefertigt und montiert. Eine Nachjustierung während des Betriebs durch den Benutzer ist nicht mehr vorgesehen und auch nicht nötig. Drift der optischen Komponenten durch Temperaturänderungen werden mittels des HeNe-Lasersignals automatisch kompensiert („Dynamic Alignment“). Während der Methodentransfer zwischen Systemen gleicher Bauart hauptsächlich durch ihr Konstruktionsprinzip und enge Fertigungstoleranzen gewährleistet werden kann, müssen weitere Dinge in Betracht gezogen werden, wenn es sich um prinzipiell unterschiedliche Messsysteme handelt. Wenn also zum Beispiel ältere dispersive NIR-Spektrometer durch moderne FT-NIR Spektrometer ersetzt und die bisher erstellten Referenzdaten und Auswertemethoden weiter genutzt werden sollen.

In diesem Fall sind die Referenzdaten des dispersiven NIR-Spektrometers meistens in festen Wellenlängen-Intervallen (l, [nm]) gespeichert, während FT-NIR Spektrometer wegen ihres Messprinzips die Daten in konstanten Wellenzahl-Intervallen (1/l, [cm-1]) erzeugen. Zusätzlich hat jede Software ihr eigenes, herstellerspezifisches Datenformat. Die Datensätze können nicht einfach in ein anderes Programm übernommen werden. Man braucht entsprechende Konversionsprogramme. Um alle diese Gesichtspunkte für den Methodentransfer vom praktischen Standpunkt aus zu untersuchen, wurde die im Folgenden beschriebene Studie an einem realen Fall durchgeführt. Es handelt sich dabei um die quantitative Bestimmung von vier Komponenten in einem pulverförmigen Produkt aus der Lebensmittelherstellung.

Experiment - Basis-Kalibration

Auf einem dispersiven NIR-Spektrometer waren 307 Referenzstandards gemessen und mit der zugehörigen Software dieses Gerätes eine gemeinsame Kalibrierung für die vier Komponenten erstellt worden. Die Originaldaten der Referenzstandards sind in konstanten Wellenlängen-Intervallen (nm) gespeichert. Mit einem Konversionsprogramm wurden diese Daten durch Interpolation in Spektren mit konstanten Wellenzahl-Intervallen (1/l, [cm-1]) umgewandelt. Da NIR-Spektren im allgemeinen keine Feinstruktur zeigen, ist dieses Verfahren ohne signifikanten Informationsverlust anwendbar. Das Konversionsprogramm fügt anschließend automatisch die Referenzdaten mit den Informationen über die Konzentrationen der Komponenten in TQ Analyst, das Chemometrie-Programm von Thermo Electron ein. Zur Erstellung der Basis-Kalibration wurden die Methodenparameter der originalen Methode soweit wie möglich übernommen

Experiment - Transfer-Kalibration

Ein Satz von 25 weiteren, neuen Referenzstandards wurden auf dem Nicolet Antaris Analysator gemessen („Integrating Sphere mit Sample Cup Spinner“). Die Messzeit war 25 Sekunden und die spektrale Auflösung betrug 8 cm-1. Diese Parameter entsprachen den Messbedingungen des dispersiven Gerätes. Zehn dieser Referenzspektren wurden als 'Inoculation'-Standards zur Basis-Kalibration zugefügt. Die restlichen fünfzehn wurden als Validierungsstandards zur Ermittlung des RMSEP-Wertes („Root Mean Square Error of Prediction“) benutzt.

Diskussion - Basis-Kalibration

Bei der Entwicklung der Basis-Kalibration wurden die Parameter der originalen (dispersiven) Methode weitgehend übernommen. Wegen spektraler Artefakte in den dispersiven Daten wurde der Spektralbereich jedoch leicht eingeschränkt (von 9090-4000 auf 8800-4100 cm-1). Die Segmentlänge in der Norris-Filterfunktion zur Berechnung der 1. Ableitung wurde von 4 auf 5 geändert Im dispersiven Referenzdatensatz waren einige Konzentrationen der Komponenten nicht spezifiziert: 43 für Komponente A, 18 für Komponente B, 22 für Komponente C und 38 für Komponente D. Die nicht-spezifierten Konzentrationen werden in TQ Analyst automatisch bei der Kalibration ignoriert, ohne dass der betreffende Referenzstandard insgesamt ignoriert werden muss.

Für einen ersten Test der Basis-Methode wurden 25 auf dem dispersiven System neu gemessene Referenzstandards ausgewertet und gegen die Werte der originalen dispersiven Methode verglichen. Die Differenzen, bedingt durch die Umwandlung der dispersiven Spektraldaten, betragen im Durchschnitt für alle Komponenten weniger als 3 Prozent

Diskussion - Transfer-Kalibration

Um Unterschiede zwischen Spektren des dispersiven Spektrometers und den Spektren des Nicolet Antaris FT-NIR-Analysators zu berücksichtigen, wurden die 25 neuen Referenzstandards auch auf diesem gemessen. 10 dieser FT-NIR Referenzspektren wurden dem Kalibrierdatensatz der Basis-Kalibration als Inoculation-Standards zugefügt. Üblicherweise würde man dazu Referenzstandards benutzen, die den gesamten Konzentrationsbereich abdecken. Die Beschaffung solcher breit angelegten Referenzstandards ist aber meistens in der Praxis mit einem größeren Aufwand verbunden. Deshalb wurde hier der Versuch gemacht, mit einem engeren Konzentrationsbereich zu arbeiten. Die übrigen 15 Spektren wurden als Validierungsstandards benutzt, um den RMSEP-Wert zu bestimmen. Nach der Rekalibration zeigte sich eine deutliche Verbesserung des RMSEP-Wertes.

Die 25 neuen Referenzstandards wurden abschließend auch auf dem dispersiven System analysiert. Die relativen Abweichungen für alle Komponenten betragen im Durchschnitt weniger als 1 Prozent. Bemerkenswert ist, dass nur etwa 3 Prozent zusätzliche Standards (10 von 307) ausreichten, um die Unterschiede zwischen den beiden sehr unterschiedlichen Analysatoren in der Methode zu berücksichtigen.

Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass der Umstieg von älteren, dispersiven NIR-Spektrometern auf moderne FT-NIR Analysatoren mit geringem Aufwand möglich ist. Eine komplette und aufwändige Neukalibrierung ist nicht erforderlich. Die Differenzen sind für eine industrielle Routineanwendung akzeptabel. Die für die Praxis wichtigen RMSEP-Werte sind vergleichbar oder verringerten sich sogar.

Zusammenfassung

NIR-Referenzdaten für eine quantitative chemometrische Methode eines dispersiven NIR-Spektrometers konnten mit einem Konversionsprogramm automatisch nach TQ Analyst übertragen und eine Basis-Kalibrierung damit erstellt werden. Durch die zusätzliche Aufnahme von wenigen weiteren FT-NIR Referenz- und Validierungsstandards konnte eine Transfer-Kalibrierung erstellt werden, mit der die Messwerte für eine 4-Komponenten-Analyse auf dem Nicolet Antaris Analysator im Durchschnitt weniger als 1 Prozent von den Werten des dispersiven Systems abweichen. Beim Ersatz eines dispersiven NIR-Spektrometers gegen ein modernes FT-NIR Analysator muss deshalb keine neue Kalibrierung von Grund auf erfolgen. Die bisherigen Methoden können mit geringem Aufwand nach kurzer Zeit weiterbenutzt werden. Die Differenzen sind für praktische Zwecke tolerierbar.

*Dr. H.-H. Belz, FTIR Applikation, Thermo Electron GmbH, 63303 Dreieich

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