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Fluoreszenzmikroskopie Schnelle Epi-Fluoreszenzmikroskopie gibt multidimeinsionale Informationen

| Autor / Redakteur: Das Gespräch führte LP-Chefredakteur Marc Platthaus / Dr. Ilka Ottleben

Eine neue fluoreszenzmikroskopische Technik zur multidimensionalen Analyse biologischer Objekte erläutert Rainer Heintzmann im LP-Interview. Außerdem beschreibt der Physiker, wie wichtig Wahrscheinlichkeiten bei dieser Methode sind.

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Rainer Heintzmann, Institute of Physical Chemistry, Friedrich-Schiller-Universität Jena und Randall Division of Cell & Molecular Biophysics, King's College London
Rainer Heintzmann, Institute of Physical Chemistry, Friedrich-Schiller-Universität Jena und Randall Division of Cell & Molecular Biophysics, King's College London
(Bild: Friedrich-Schiller-Universität Jena)

LABORPRAXIS: Herr Prof. Heintzmann, Ihre Arbeitsgruppe beschäftigt sich mit der Entwicklung neuer Techniken zur Messung multidimensionaler Informationen in kleinen biologischen Objekten. Sie haben kürzlich ein neues Auswertungsverfahren mitentwickelt, das es Ihnen erlaubt, biologische Strukturen in lebenden Zellen sehr viel schneller und mit weniger Aufwand als bisher abzubilden. Wie gelingt Ihnen das?

Prof. Dr. Rainer Heintzmann: Das von Susan Cox und Edward Rosten entwickelte 3B-Verfahren, das Sie ansprechen, ermöglicht es, hochauflösende Filme von lebenden Zellen zu erhalten. Experimentell betrachtet, ist es eigentlich nur ein normales Epi-Fluoreszenzmikroskop mit einer schnellen sensitiven Kamera. 3B bedeutet übrigens „Bayesian analysis of blinking and bleaching“, also die wahrscheinlichkeitstheoretische Analyse sich überlagernder Bilder von blinkenden und bleichenden Einzelmolekülen. Bekannte pointilistische Verfahren wie PALM, fPALM, STORM oder GSDIM erreichen Ihre hohe Auflösung dadurch, dass alle einzelnen Moleküle nacheinander aufgenommen und jeweils präzise lokalisiert werden. Dazu müssen starke Laserstrahlen die meisten Moleküle in einen Dunkelzustand versetzen, sodass immer nur sehr wenige Moleküle pro Bild gleichzeitig sichtbar sind. Selbst mit modernster Kameratechnik führen diese Verfahren zu recht langen Aufnahmezeiten.

In 3B haben wir diese Rahmenbedingungen aufgehoben und erlauben es vielen Molekülen, gleichzeitig überlappend sichtbar zu sein. Unsere Rekonstruktionsergebnisse sind als Wahrscheinlichkeitskarten des Vorhandenseins von Fluoreszenzmolekülen zu verstehen. Anhand der Daten können wir nicht mehr mit Sicherheit sagen, wo genau sich jedes einzelne Molekül befand, aber in der Gesamtheit, z.B. aus jeweils 200 Bildern, können wir eben doch mit hoher Auflösung solche Wahrscheinlichkeitskarten zeichnen. Diese Karten sind ästhetisch schön, weil sie ein kontinuierliches Aussehen haben. Dennoch sollte man nicht vergessen, dass sich letztlich doch eine endliche, nicht mehr genau bestimmbare Anzahl diskreter Moleküle hinter diesen Bildern verbirgt.

LABORPRAXIS: Welche Vorteile zeigen sich gegenüber den herkömmlich verwendeten Verfahren?

Heintzmann: Ein Vorteil ist, dass es uns mit dem 3B-Verfahren gelingt, lebende spezifisch markierte Fluoreszenzproben mit einer hohen Ortsauflösung von etwa 50 nm und einer Zeitauflösung von etwa 4 s abzubilden, und das über einen Gesamtzeitraum von z.B. 100 s. Damit ist 3B deutlich schneller als die konventionelle pointilistische Bildgebung. Ein weiterer Vorteil ist, dass bei solchen Experimenten auch mit einer normalen Quecksilberdampflampe statt eines Lasers beleuchtet werden kann. Von der algorithmischen Seite her ist unserer Verfahren allerdings viel aufwändiger als herkömmliche pointilistische Verfahren. Um eine 1,5 µm x 1,5 µm Wahrscheinlichkeitskarte zu erstellen, benötigt ein i7 Prozessor Core mit 3,33 GHz etwa 6 h Rechenzeit.

LABORPRAXIS: An welchem Modellsystem haben Sie die neue Software erprobt? Welche neuen Erkenntnisse haben sich hierbei gezeigt?

Heintzmann: Das 3B-Verfahren wurde an lebenden THP-1-Zellen, ein Zelllinie aus der akut myeloischen Leukämie, erprobt, in denen eine gestutzte Version des „Talin“-Moleküls als mCherry-Konstrukt vorlag. Diese Zellen neigen dazu, Podosomen zu formen, in denen Talin schöne ringartige Strukturen zeigt. Uns ist es gelungen, Filme vom Prozess der Bildung und des Abbaus dieser Podosomen mit hoher Auflösung zu erhalten. Dabei kann man jetzt erkennen, dass Podosomen typischerweise eine fünf- oder sechseckige Struktur haben, an deren Ecken kleine Proteinstränge hängen. Aus diesen Filmen hat sich die Vermutung ergeben, dass diese Proteinstränge bei der Bildung neuer Podosomen eine wichtige Rolle spielen. Beim Prozess des Abbaus von Podosomen hat das 3B-Verfahren wiederum die Erkenntnis geliefert, dass es dort zwei verschiedene Arten zu geben scheint: Eine Art „Abwickeln“ und ein „ins-Zentrum-ziehen“.

LABORPRAXIS: Welche Anwendungsbereiche sehen Sie außerdem?

Heintzmann: Ich denke, dass sich 3B vielfältig anwenden lässt; vor allem bei biologischen Fragestellungen, die 50-nm-Auflösung benötigen, aber bei denen herkömmliche pointilistische Einzelmolekülverfahren zu langsam sind. Als weitere Beispiele könnte ich mir die Beobachtung von Details während der Transkription, Zellteilung oder Endozytose vorstellen. Der Anwendbarkeit ist natürlich auch zuträglich, dass der experimentelle Aufwand, wenn man ein Epi-Fluoreszenz-Weitfeld-Mikroskop mit einer schnellen Kamera besitzt, klein ist. Man braucht keinen Laser. Außerdem ist die Rekonstruktionssoftware unter http://www.coxphysics.com/3b/ frei erhältlich.

Vielen Dank für das Gespräch Herr Prof. Heintzmann.

Literatur:

[1] S. Cox, E. Rosten, J. Monypenny, T. Jovanovic-Talisman, D. T. Burnette, J. Lippincott-Schwartz, G. E. Jones und R.Heintzmann; Bayesian localization microscopy reveals nanoscale podosome dynamics; Nature Methods 9, 195-200, 2012.

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