Schüttelkolben: Gelösten Sauerstoff und pH nicht-invasiv messen

Mikrobielle Fermentation und Zellkultur Schüttelkolben: Gelösten Sauerstoff und pH nicht-invasiv messen

16.10.2017Autor / Redakteur: Alexander Komitakis et al.* / Dr. Ilka Ottleben

Zu den Schlüsselparametern in der mikrobiellen Fermentation und Zellkultur gehören gelöster Sauerstoff und der pH-Wert. Oft ist es hilfreich, diese Parameter über entsprechende Sensoren direkt im Schüttelkolben in Echtzeit verfolgen zu können. Ein Bericht aus dem Praktikumssaal.

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Abb. 1: Biotechnologie-Studenten untersuchen Vorkulturen eines Pipecolinsäuse-produzierenden C.-glutamicum-Stammes unter variierenden Bedingungen, wobei der SFR Shake Flask Reader zur Überwachung des gelösten Sauerstoffs verwendet wird.
(Bild: Hochschule Esslingen)

Gelöster Sauerstoff und pH sind Schlüsselparameter in der mikrobiellen Fermentation und Zellkultur. Am Lehrstuhl für Biotechnologie der Hochschule Esslingen wird die Bedeutung dieser Parameter für die Bioprozessentwicklung sowie verschiedene Messmethoden den Studenten des Bachelor- (B. Sc. Biotechnology) und Masterprogramms (M. Eng. Bioprocess Engineering) vermittelt. In Mess- und Kontrollversuchen lernen sie, neben anderen Lehrinhalten, die Messprinzipien und Anwendungen von Clark-Elektroden, optischen Sensoren und pH-Sonden kennen. Die Studenten benutzen diese Sensoren in Laborkursen und Projektarbeiten, um die entsprechenden Parameter in Bioreaktoren zu überwachen und zu kontrollieren. Gerade Sauerstoff und pH konnten aber bisher in Vorkulturen, die hauptsächlich in Erlenmeyerkolben durchgeführt werden, nicht in Echtzeit verfolgt werden. Während für die pH-Bestimmung Offline-Proben gezogen werden konnten, gab es keine praktikable Methode zur Überwachung des gelösten Sauerstoffs in Schüttelkolbenkultur. Daher waren die Kulturen oft sauerstofflimitiert, was zu reduzierter Produktivität oder sogar zum Absterben der Zellen führte.

Der SFR Shake Flask Reader (SFR) von Presens erlaubt es hingegen, gelösten Sauerstoff sogar in 100- bis 1000-ml-Schüttelkolben zu überwachen. Da bis zu neun Kolben gleichzeitig überwacht werden können, lassen sich mehrere Experimente parallel durchführen. In einem Laborkurs innerhalb des Masterprogramms zu „Prokaryotischen Bioprozessen“ wird das SFR benutzt, um Vorkulturen von Corynebakterium glutamicum zu optimieren. Die Studenten lernen dabei die Auswirkungen bestimmter Faktoren auf das Zellwachstum kennen, indem die Kolbengeometrie, das Füllvolumen oder die Schüttelgeschwindigkeit variiert werden. Darüber hinaus wird der Einfluss verschiedener Kolbenverschlüsse sowie die Zugabe von Antischaummitteln getestet.

Bildergalerie

Abb. 2: Schüttelkolben mit Schikanen, integriertem Sauerstoff-Sensor-Spot und unterschiedlichen Kappen wurden für die Experimente verwendet.

Abb. 3: Gelöster Sauerstoff (DO) von C. glutamicum in Mineralsalzmedium (+ Glukose) in Glas-Schüttelkolben mit Schikanen: Vergleich von Kulturen in Kolben mit Aluminium- und Silikonkappen und 20% Füllvolumen bei 130 rpm und 150 rpm (A); Vergleich von Kulturen mit 20% Füllvolumen bei 130 und 150 rpm, mit und ohne Silikonkappen und Antischaummittel (B); Vergleich von Kulturen mit 20% und 15% Füllvolumen, bei 150 rpm mit Silikonkappen (C).

Das SFR wird zusätzlich für Studentenprojekte benutzt, bei denen die Studenten wissenschaftliche Fragen wie die kLa-Quantifizierung in Schüttelkolben bei unterschiedlichen Bedingungen, die Optimierung von Wachstumsmedien oder die Produktion rekombinanter Proteine, selbstständig untersuchen sollen.

Material und Methoden

Zur Optimierung eines Pipecolinsäure produzierenden C.-glutamicum-Stammes untersuchten die Studenten den Einfluss des Füllvolumens (15 % und 20 %), der Schüttelgeschwindigkeit (130 rpm oder 150 rpm), der Kolbenverschlüsse (Aluminium- oder Silikonfilter-Kappen) sowie die Zugabe von Antischaummittel. Die Kultivierungen wurden in CgXII-Minimalmedium mit 20 g/l Glukose bei 30 °C durchgeführt. Dafür wurden 500 ml-Schott-Duran-Schüttelkolben mit vier Schikanen (s. Abb. 2) verwendet. Der gelöste Sauerstoff wurde mit dem SFR und in die Kolben integrierten, autokalvierbaren Sauerstoff-Sensor-Spots in Intervallen von 1 min gemessen. Zusätzlich wurde das Biotrockenmasse und die Glukosekonzentration nach 22-stündiger Kultivierung bestimmt. Jeder Versuchsansatz wurde zwei Mal ausgeführt. Das Experiment wurde nicht statistisch analysiert, aber die gemessenen Kurvenverläufe zeigten keine signifikanten Abweichungen. Zur Vereinfachung werden nur die gelösten Sauerstoff-Daten eines der doppelt durchgeführten Versuchsansätze im Folgenden dargestellt.

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