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Automatisierte Zell-Analytik von Blutproben Tropfen für Tropfen gegen Krebs

Von Janis Stiefel, Dr.Christian Freese *

Mit einer einfachen Blutprobe lässt sich eine verborgene Krebserkrankung erkennen. Dies gelingt mittels Isolation und Analyse zirkulierender Tumorzellen, die den molekularen Fingerabdruck des Tumors repräsentieren und Ansatzpunkte zur Bekämpfung der Erkrankung liefern. Fraunhofer Forscher haben nun eine automatisierte Plattform für diese Krebsanalytik entwickelt.

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Abb.1: Aus Blutproben lassen sich zirkulierende Tumorzellen isolieren und für individuelle Therapieansätze nutzen.
Abb.1: Aus Blutproben lassen sich zirkulierende Tumorzellen isolieren und für individuelle Therapieansätze nutzen.
(Bild: ©ArtemisDiana - stock.adobe.com)

Etwa eine von acht Frauen erkrankt im Laufe ihres Lebens an Brustkrebs. Damit ist diese Tumor-Art die mit Abstand häufigste Krebserkrankung bei Frauen, wie aus dem Zentrum für Krebsregisterdaten des Robert-Koch-Instituts hervorgeht. Obwohl Brustkrebs nach wie vor eine ernstzunehmende Erkrankung ist, gibt es dank Früherkennung und vielfältiger Behandlungsmethoden heute eine vergleichsweise hohe Heilungschance: Bei frühzeitiger Diagnose und Therapie wird eine relative Zehn- Jahres-Überlebensrate von 82 % verzeichnet. Anders stehen die Chancen allerdings, wenn der Krebs zu spät entdeckt wird und streut oder bereits gestreut hat. Dann wird er zur lebensbedrohlichen Krankheit – rund 90 % der krebs­assoziierten Sterblichkeit gehen auf die Bildung weiterer Tumore (Meta­stasierung) im Körper zurück. Während des komplexen Metastasierungsprozesses breiten sich so genannte zirkulierende Tumorzellen (circulating tumor cells, CTCs) vom Primärtumor in umliegende Gewebe aus und gelangen später durch das Gefäßsystem in entfernte Organe.

Zirkulierende Tumorzellen zur Früherkennung nutzen

Da die im Blut zirkulierenden Tumorzellen entscheidende Informationen bezüglich des Tumorursprungs und prädiktive Eigenschaften aufweisen, wird seit geraumer Zeit ausführlich diskutiert, wie diese Zellen aus Blutproben isoliert und charakterisiert werden können. Im allgemeinen Konsens der Wissenschaftsgemeinde hat die Flüssigbiopsie (Liquid Biopsy) das Potenzial, die Diagnostik von Tumorerkrankungen und somit auch deren Therapie zu optimieren. Zurzeit liegt der Fokus auf der Analyse von freier zirkulierender Tumor-DNA (circulating tumor (ct)DNA). Die Isolation und Charakterisierung intakter zirkulierender Zellen bietet aber einen breiteren diagnostischen Werkzeugkasten und daraus abzuleitende Erkenntnisse, um neue Tumormarker zu finden und personalisierte Therapie zu entwickeln. Ein maßgeblicher Faktor der Isolation von CTCs besteht in der minimal-invasiven Gewinnung intakter Tumorzellen, die zusätzliche Analysen auf RNA-, Genom- sowie auf Proteinebene oder die Kultivierung der Zellen ermöglicht. So steht beispielsweise das komplette Antigen-Repertoire der Tumorzelle für personalisierte immun- und zelltherapeutische Ansätze zur Verfügung, z. B. für die Produktion spezieller, Krebszellen-attackierender Immunzellen im Reagenzglas.

Automatisierte Diagnostik im Chip-Format

An soliden Primärtumoren wird bereits das Prinzip des molekularen Profilings von Krebszellen durchgeführt. Dieses lässt sich mit der richtigen Technologie auf die Analyse der CTCs im Blut übertragen, um durch zielgerichtete medikamentöse sowie ganzheitliche Bekämpfung des Tumors das Risiko eines Rückfalls zu senken. Den Prozess für eine klinische Standardisierung zu automatisieren, entpuppt sich allerdings als Hürdenlauf. Nichtsdestotrotz hat es sich das Fraunhofer-Institut für Mikrotechnik und Mikrosysteme (Fraunhofer IMM) in Mainz zur Aufgabe gemacht, ein automatisiertes System zur Anreicherung, Detektion und Einzelzellisolation von zirkulierenden Tumorzellen aus einer 7,5-mL-Blutprobe zu entwickeln. Als Kerntechnologie fungiert dabei die Mikrofluidik, die die Detektion einzelner Zellen im Probenstrom ermöglicht, um Tumorzellen in Echtzeit selektiv und hochspezifisch in einzelne Kavitäten zu isolieren und für Analysen zur Verfügung zu stellen.

Das am Fraunhofer IMM entwickelte CTCelect-System funktioniert ähnlich wie das einzige von der US-Behörde FDA zugelassene System Cell Search (s. Abb. 2): Es basiert auf Mikropartikeln, die gegen den Tumormarker EpCAM funktionalisiert sind. Damit werden die Zellen in der Blutprobe immunomagnetisch aufkonzentriert.

Abb.2: Der mikrofluidische Chip (l.) bildet das Herzstück der CTCelect-Plattform (r.) zur automatisierten Isolation von zirkulierenden Tumorzellen aus Patientenblut. Eine standardmäßige 7,5 mL Blutprobe reicht als Ausgangsmaterial aus.
Abb.2: Der mikrofluidische Chip (l.) bildet das Herzstück der CTCelect-Plattform (r.) zur automatisierten Isolation von zirkulierenden Tumorzellen aus Patientenblut. Eine standardmäßige 7,5 mL Blutprobe reicht als Ausgangsmaterial aus.
(Bild: Stiefel)

Der Vorteil im Gegensatz zu Cell Search ist, dass die CTCs nach der Anreicherung mit fluoreszenz-basierter Zellsortierung in einem mikrofluidischen Chip einzeln dispensiert werden können. Der Einsatz eines kostengünstigen Einwegchips verhindert eine Kreuzkontamination zwischen den Patientenproben (s. Abb. 2). Mit verschiedensten optischen Filter lassen sich Krebs- und Blutzellen in einen grünen und roten Fluoreszenzkanal zytometrisch unterscheiden. Ferner beschränkt sich die Isolation mit der neu entwickelten Plattform nicht nur auf den Einsatz von Tumormarkern wie EpCAM, sondern ist hochflexibel und kann für die Konzeption klinischer Untersuchungen leicht angepasst werden.

Hohe Wiederfindungsraten im Test

Aufbau und Weiterentwicklung des neuen Systems ermöglicht einen Prozess, der bereits für die automatisierte Isolation von wenigen Einzelzellen in 7,5 mL Zellkulturmedium und humanem Vollblut prävalidiert wurde. Dazu hatten die Fraunhofer-Forscher 20 Einzelzellen im Labor kultiviert, fluoreszent markiert und abgezählt in die Blutprobe gegeben. Für die Testung des Systems wurde u. a. die Brustkrebszelllinie MCF-7 eingesetzt und eine Wiederfindungsrate von 87 % in der immunomagnetischen Anreicherung und 73 % für die Einzelzell­detektion und -dispensierung der Brustkrebszellen erreicht. So wurden nach dem automatisierten Gesamtablauf sowohl aus dem Medium als auch aus dem Blut ohne signifikante Unterschiede fast 60 %, also 12 der 20 gesuchten Tumorzellen unter den Milliarden von Blutzellen in der Probe wiedergefunden und einzeln isoliert (s. Abb. 3).

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Abb.3: Wiederfindungsraten von automatisiert isolierten Brustkrebszellen aus 7,5 mL Zellkulturmedium und menschlichem Vollblut (l.). Die Zellen werden anhand ihres Fluoreszenzsignal im mikrofluidischen Chip detektiert und dann tröpfchenweise auf eine Mikrotiterplatte als Einzelzellen dispensiert (r.).
Abb.3: Wiederfindungsraten von automatisiert isolierten Brustkrebszellen aus 7,5 mL Zellkulturmedium und menschlichem Vollblut (l.). Die Zellen werden anhand ihres Fluoreszenzsignal im mikrofluidischen Chip detektiert und dann tröpfchenweise auf eine Mikrotiterplatte als Einzelzellen dispensiert (r.).
(Bild: Stiefel)

Im Anschluss dieses Gesamtprozesses wies das Forscherteam nach, dass eine molekulare Charakterisierung (z. B. RT-PCR) der Einzelzellen hinsichtlich tumorrelevanter Oberflächenmarker und Hormonrezeptoren möglich ist. Die Resultate dieses Vorhabens legen den Grundstein zur klinischen Anwendung des neuen Prozesses für Diagnostik- und Therapiemaßnahmen für beispielsweise metastasierten Brustkrebs oder rezidiven Kopf-Hals-Krebs.

So funktioniert der Krebszellen-Nachweis

Für den Nachweis der CTCs machen sich die Fraunhofer-Forscher die molekulare Oberfläche der Zellen zu Nutze. Zirkulierende Tumorzellen entspringen meist den Deck- und Drüsengewebeschichten (epitheliale Zellen) und können daher i. d. R. mit Antikörpern gegen epitheliale Oberflächenmoleküle wie EpCAM markiert und von den Blutzellen unterschieden werden. Um die Krebszellen anschließend von den gesunden Blutzellen zu trennen, bedienen sich Biochemiker eines Tricks: Die Antikörper werden auf magnetischen Partikeln fixiert, sodass sich die daran gebundenen Tumorzellen magnetisch „einfangen“ lassen.

Darüber hinaus können die Antikörper mit fluoreszent leuchtenden Verbindungen gekoppelt werden, was man in der so genannten Fluoreszenz-basierten Zytometrie in einem mikrofluidischen Chip anwendet. Wird ein ausreichend hohes Fluoreszenzsignal einer Zelle im Probenstrom gemessen und stimmen weitere Parameter wie Objektgröße und Geschwindigkeit mit den in der Software eingestellten Richtwerten überein, wird diese Zelle mit einem Druckstoß aus der Düse des Chips in eine einzelne Kavität einer Mikrotiterplatte dispensiert. All diese Teilschritte wurden in der neuent­wickelten Plattform automatisiert und hintereinandergeschaltet.

Vorarbeit für bessere personalisierte Medizin

Durch die Zusammenarbeit mit der Universitätsmedizin in Mainz und in Essen wurden mithilfe der hinter CTCelect stehenden Plattform erste wichtige Erkenntnisse für Methoden zum CTC-Monitoring bei krebskranken Patienten gewonnen. So war es bereits möglich, potenziell vom Tumor abstammende Zellen automatisiert aus den Blutproben zu vereinzeln, zu zählen und krankheitsrelevante Marker in den einzelnen Zellen nachzuweisen. Besonders kritisch werden dabei die CTCs betrachtet, die sich bereits im Vergleich zu ihrem epithelialen Ursprungstumorgewebe verändert haben und dadurch mit einer hohen Bösartigkeit (Malignität) und Invasivität korrelieren. Infolge des enormen Selektionsdruck durch Radio- und Chemotherapie und der hohen Teilungsrate von Tumorzellen wird die Evolution und damit Mutationsrate bei Krebskrankheiten lawinenartig beschleunigt. Das heißt, dass Tumorzellen eine Art therapieresistenten Stammzellcharakter erlangen können oder durch die Ausbildung mesenchymaler Eigenschaften für die Zellen des Immunsystems unsichtbar werden. Genau mit diesem Ansatzpunkt verwendeten die Forscher anhand ihres Systems gezielt nicht nur epitheliale, sondern auch mesenchymale Marker für die Isolation potenzieller CTCs aus Blutproben von Kopf-Hals-Krebs-Patienten. Die Unterscheidungen wurden dann mittels PCR auf mRNA-Ebene bestätigt (s. Abb. 4). In Zukunft können solche Einteilungen ein klareres Bild der Gesamterkrankung abbilden und unterstützend bei Therapieentscheidungen Anwendung finden.

Abb.4: Mithilfe der neuentwickelten automatisierten Plattform konnten einzelne zirkulierende Tumorzellen aus Blutproben von Krebspatienten minimal-invasiv isoliert und anhand der Expression ihrer Oberflächenmerkmale in wichtige Untergruppen klassifiziert werden. Zur Bestimmung von CTCs dient grundsätzlich ein Nachweis von epithelialen Markern wie EpCAM und Stratifin. Ist zusätzlich eine Isolation durch Oberflächenmoleküle wie Integrin und Stammzellmarker wie VCAM-1 und deren PCR-Nachweis möglich, könnte dies potenziell für eine höhere Metastasierungsfähigkeit dieser CTCs sprechen.
Abb.4: Mithilfe der neuentwickelten automatisierten Plattform konnten einzelne zirkulierende Tumorzellen aus Blutproben von Krebspatienten minimal-invasiv isoliert und anhand der Expression ihrer Oberflächenmerkmale in wichtige Untergruppen klassifiziert werden. Zur Bestimmung von CTCs dient grundsätzlich ein Nachweis von epithelialen Markern wie EpCAM und Stratifin. Ist zusätzlich eine Isolation durch Oberflächenmoleküle wie Integrin und Stammzellmarker wie VCAM-1 und deren PCR-Nachweis möglich, könnte dies potenziell für eine höhere Metastasierungsfähigkeit dieser CTCs sprechen.
(Bild: Stiefel)

Gemäß dem Gesetz der großen Zahlen müssen die vielversprechenden Ergebnisse aus den ersten Screenings, wie immer beim Brückenschlag von der Technologieentwicklung, über Machbarkeitsstudien bis in die Klinik, in größeren Studien gefestigt werden. Allerdings ist bereits eine Vielzahl an Immuntherapeutika, die gezielt antagonistisch auch auf die hier nachgewiesenen Oberflächenmarker wirken, kommerziell erhältlich. In der molekularen Onkologie wird seit Jahrzehnten an maßgeschneiderten mRNA-Wirkstoffen geforscht. Nicht zuletzt durch die rasante Weiterentwicklung der Technologien und das explodierende Wirtschaftsvolumen im entsprechenden Sektor sind in den nächsten Jahren große Fortschritte zu erwarten. Der genaue Bauplan relevanter Tumorproteine in den isolierten CTCs kann hier einen entscheidenden Beitrag im Kampf gegen Krebs leisten. Das CTCelect-System bietet somit die Möglichkeit, die Entwicklung neuer Therapieansätze zu beschleunigen. Dabei ist es flexibel und ermöglicht es der Forschung, relevante Tumormarker durch die kontaminationsarme Einzelzellisolation eindeutiger zu charakterisieren und mit Krankheitsverläufen in Zusammenhang zu bringen.

* J. Stiefel, Dr. C. Freese, Fraunhofer-Institut für Mikrotechnik und Mikrosysteme IMM, 55129 Mainz

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