UHPLC mit frisch aufbereitetem Reinstwasser betreiben

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Um UHPLC-Systeme vor Beschädigungen durch Partikel zu schützen, bieten manche Lösungsmittelhersteller nun Wasser und organische Lösungsmittel an, die mit einem 0,1-µm-Filter filtriert wurden. Da Wasseraufbereitungssysteme in der Regel mit einem 0,22-µm-Endfilter ausgestattet sind, wurde untersucht, ob diese Filtration ausreichend ist, oder ob ein zusätzlicher Filtrationsschritt notwendig ist. Abbildung 2 zeigt den Rückdruck eines Systems, das 10 h bei bei kontinuierlichem isokratischen Fluss beobachtet wurde, wenn Reinstwasser zur Herstellung einer 50%igen Acetonitril-Mobilphase verwendet wurde. Der Systemrückdruck blieb während der gesamten Zeit stabil (ΔP = 24 – 27 psi). Dies bedeutet, dass frisch aufbereitetes Reinstwasser von einem System mit einem 0,22-µm-Endfilter zur Verwendung mit UHPLC-Systemen geeignet ist. Ein zusätzlicher Filtrationsschritt ist nicht erforderlich, insbesondere da eine Filtration eine Kontamination verursachen kann, wenn nicht der richtige Filter verwendet wird [4].

Reinstwasser-Gradientenprofil

Spuren organischer Moleküle im Wasser, das zur Herstellung von Elutionsmitteln verwendet wird, haben erwartungsgemäß einen negativen Einfluss auf UHPLC-Analysen. Sie können Basislinien und die Empfindlichkeit der analytischen Methode beeinträchtigen, sich während der Äquilibrierung auf der Reversed-Phase-Säule ansammeln und später als Fremdpeaks eluieren. Das Ausmaß einer organischen Kontamination im Wasser kann anhand des Gradientenprofils beurteilt werden. Dazu wird eine Gradientenelution von einer hohen Konzentration an wässrigem Elutionsmittel auf eine hohe Konzentration an organischem Elutionsmittel ohne Probeninjektion durchgeführt. Wenn organische Verunreinigungen im Wasser vorhanden sind, ist zu erwarten, dass sie sich während der Äquilibration mit dem wässrigen Elutionsmittel in der Säule ansammeln und später während des Gradientenlaufs eluieren. Bei Verwendung von Reinstwasser wurde eine gute Basislinie erzielt (s. Abb. 3), womit seine Eignung für die UHPLC angezeigt wird.

Reinstwasser frisch aufbereitet

Um die Eignung von Reinstwasser für UHPLC-Analysen noch weiter zu demonstrieren, wurde ein Gemisch aus sieben Substanzen wiederholt durch Gradientenelution analysiert. Der Rückdruck und die Qualität der Trennung wurden über 600 aufeinander folgende Analysen (60 h ununterbrochener Einsatz) beobachtet. Abbildung 4 zeigt, dass der Systemrückdruck über die wiederholten Injektionen vollkommen stabil blieb. Ferner war die chromatographische Leistung gut und blieb während der zahlreichen Analysen, die in diesem Versuch durchgeführt wurden, unverändert. Um diese Ergebnisse zu illustrieren, werden die Chromatogramme des 1. und 600. Laufs in Abbildung 5 gezeigt. Diese Ergebnisse bestätigen, dass frisch aufbereitetes Wasser gut zur Verwendung in UHPLC-Versuchen geeignet ist. Beim Einsatz eines 0,22-µm-Endfilters an der Entnahmestelle des Wasseraufbereitungssystems ist keine weitere Filtration erforderlich, insbesondere da wie bereits erwähnt durch die Filtration eine Kontamination verursacht werden kann, wenn der falsche Filter verwendet wird.

Schlussfolgerung

Während konventionelle HPLC-Systeme allmählich durch UHPLC-Systeme ersetzt werden, ist zu klären, welche Lösungsmittel am besten für diese Systeme geeignet sind. Diese Studie zeigte, dass frisch aufbereitetes Reinstwasser zur Verwendung mit UHPLC-Systemen geeignet ist und dazu beiträgt, eine stabile Basislinie und optimale chromatographische Leistung zu erzielen.

Wie durch den fehlenden Anstieg des Rückdrucks gezeigt wurde, gewährleistet ein 0,22-µm-Endfilter an der Entnahmestelle des Wasseraufbereitungssystems, dass Partikel und Bakterien, die mit der ordnungsgemäßen Funktion des Geräts interferieren könnten, entfernt werden. Es muss jedoch unbedingt sichergestellt werden, dass das Wasseraufbereitungssystem in optimalem Betriebszustand gehalten wird und Wasser mit einem niedrigen Ionengehalt (Widerstand von 18,2 ΩOhm•cm) sowie einem geringen Gehalt an organisch gebundenem Kohlenstoff (TOC von 5 ppb oder darunter) erzeugt. Da die Wasserqualität mit der Zeit abnehmen kann, sollte Reinstwasser für die UHPLC außerdem nicht länger als einen Tag gelagert, sondern jeden Morgen frisch entnommen werden.

Literatur

[1] D. Guillarme, J. Schappler, S. Rudaz, J.L. Veuthey, „Coupling ultra-high-pressure liquid chromatography with mass spectrometry,“ Trends in Analytical Chemistry, 2010, 29(1), 15-27.

[2] S. Liu, „Quality Evaluation of HPLC-Grade Acetonitrile,“ Am. Laboratory, 2008, 40, 22-29.

[3] M. Tarun, C. Monferran, C. Devaux and S. Mabic. „Improving chromatographic performance by using freshly delivered ultrapure water in the mobile phase,“ LCGC, The Peak, 2009, Juni, 7-14.

[4] S. Kulkarni, J. George and V. Joshi, „Mobile Phase Preparation for UHPLC: Impact of Filtration Through 0.2-μm Membranes on System Performance,“ American Biotechnology Laboratory, 2008, 26(10), 14-15.

Die Autoren danken Dr. Jean-Michel Plankeele (Waters Corp.) und Dr. Marijn Van Hulle (Waters Corp.) für ihre freundliche Hilfe und Unterstützung.

* *E. Riché, A. Khvataeva, S. Mabic: Merck Millipore, St.-Quentin-en-Yvelines, Frankreich

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