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Reinstwasser

Wie wichtig ist das Reinstwasser für die HPLC?

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Auswirkungen einer organischen Kontamination auf HPLC-Analysen

Erwartet wurde im ersten Versuch, dass während der einstündigen Vorkonzentrierung jegliche organischen Verunreinigungen im Wasser am Kopf der Säule adsorbieren würden. Bei der Elution würden diese organischen Stoffe von der Säule eluieren und als Peaks im Chromatogramm erscheinen. Abbildung 2 zeigt das Ausmaß der organischen Kontamination in HPLC-reinem Flaschenwasser. Sowohl Abbildung 2a (bei 254 nm) als auch Abbildung 2b (bei 214 nm) zeigen, dass bei Verwendung von HPLC-reinem Flaschenwasser mehr Peaks entstanden, die bis zu 15 Mal höher waren als bei vorkonzentriertem frisch erzeugtem Reinstwasser.

Für den zweiten Versuch sind die Chromatogramme der Injektionen Nr. 50, 290, 530, 770, 1010 und 1310 in den Abbildungen 3 (254 nm) und 4 (214 nm, auf www.laborpraxis.de) dargestellt. Die Basisliniendrifts weisen erhebliche Unterschiede auf. Wenngleich bei der Gradientenelution – insbesondere bei niedrigen Wellenlängen – Basisliniendrifts zu erwarten sind, deuten die starken unregelmäßigen Drifts, die bei Verwendung von HPLC-reinem Flaschenwasser beobachtet wurden (Abb. 3a), jedoch an, dass sich im Laufe der Zeit Verunreinigungen an der Säule angesammelt haben. Bei Verwendung von frisch erzeugtem Reinstwasser (s. Abb. 3b) wurden solche Basisliniendrifts nicht beobachtet. Ein weiterer Unterschied zwischen den beiden Wasserquellen ist das Auftreten von Fremdpeaks bei Verwendung von HPLC-reinem Flaschenwasser, was wiederum auf eine organische Kontamination der wässrigen mobilen Phase hindeutet. Das Auftreten von Fremdpeaks in einem Chromatogramm ist kritisch, wenn Proben mit unbekannten Inhaltsstoffen analysiert werden. Ferner besteht die Möglichkeit, dass der Fremdpeak irrtümlich als ein Probenbestandteil interpretiert wird oder mit einem Analyten coeluiert und dadurch Probleme bei der Quantifizierung verursacht. Bei der Verwendung von HPLC-reinem Flaschenwasser erscheinen die ersten Fremdpeaks in den Chromatogrammen bei 254 nm (nach ~5 min, Injektion Nr. 770) und bei 214 nm (nach ~15 min, Injektion Nr. 530), wie die Abbildungen 3a und 4a zeigen. Die Fläche des Fremdpeaks bei ~5 min in Abbildung 3a ist über dreimal größer als der Phenobarbital-Peak (Peak Nr. 3) und über zweimal größer als der Phenytoin-Peak (Peak Nr. 5).

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Die Säule muss vor jeder HPLC-Gradienteninjektion auf die Ausgangsbedingungen äquilibriert werden. Dazu sind in der Regel fünf bis zehn Säulenvolumina der ursprünglichen mobilen Phase [12] erforderlich, die normalerweise mindestens um zwei Größenordnungen größer als das Probeninjektionsvolumen [9] sind. Im vorliegenden Versuch ist das Äquilibriervolumen 200 Mal größer als das injizierte Probenvolumen. Nach dieser ausgiebigen Äquilibrierung überrascht es daher nicht, dass Spurenverunreinigungen in der wässrigen mobilen Phase bedeutende Interferenzen in den Chromatogrammen verursachen.

Wenn die HPLC zur Identifizierung von Peaks und/oder Quantifizierung kleiner Analytenmengen eingesetzt wird, können unerwünschte Hintergrund-Peaks infolge einer Kontamination der mobilen Phase die Genauigkeit, Präzision und/oder Empfindlichkeit der Methode reduzieren und die Peak-Identifizierung bzw. die Quantifizierung beeinträchtigen.

Schlimmstenfalls kann das Chromatogramm aufgrund der rauschenden Basislinie und der Fremdpeaks völlig nutzlos sein.

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