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Biosensorik Zell-Transistor Biosensorik an Rezeptoren

Autor / Redakteur: Ingmar Peitz und Peter Fromherz* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Transistoren auf Halbleiterchips können kleine Spannungsänderungen an der Oberfläche kultivierter Zellen detektieren. Münchener Forscher nutzen dieses Prinzip, um die Aktivität ligandengesteuerter Ionenkanäle zu untersuchen. Diese Zell-Transistor Biosensorik schafft eine Alternative zur sonst häufig eingesetzten planaren Patch-Clamp-Technik. Der Beitrag beschreibt ein Modellexperiment mit einem Serotonin-Rezeptor.

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Abb. 1 „Rezeptor-Zell-Transistor Biosensorik“ mit dem Serotonin-Rezeptor 5-HT3A: Schema des Testexperiments.
Abb. 1 „Rezeptor-Zell-Transistor Biosensorik“ mit dem Serotonin-Rezeptor 5-HT3A: Schema des Testexperiments.
( Archiv: Vogel Business Media )

Ligandengesteuerte Ionenkanäle sind im Rahmen der Wirkstoffentwicklung häufig Zielstrukturen für experimentelle Analysen. So lässt sich beispielsweise die Wirkung von Pharmaka oder Toxinen an ihnen beobachten. Zur Untersuchung der Kanäle stehen heute bereits mehrere Methoden auf der Basis Zell-basierter Assays zur Verfügung. Bei großen Screeningkampagnen kommen dabei meist Fluoreszenzfarbstoffe zum Einsatz, die auf den Ionenstrom durch die Kanäle reagieren. Im weiteren Verlauf wird oft die Patch-Clamp-Technik eingesetzt. Dabei werden die Zellen im einfachsten Fall mit einer Mikropipette kontaktiert, die eine Elektrode enthält. Mit dieser Elektrode lässt sich der Strom durch die Ionenkanäle messen. Seit einigen Jahren hat sich die planare Patch-Clamp-Technologie als Standard etabliert. Diese erlaubt es, auch mehrere Zellen parallel und automatisiert zu verarbeiten. Forscher am Max-Planck-Institut für Biochemie in Martinsried haben jetzt eine auf Zell-Transistoren basierende Methode entwickelt, mit der sich, analog zur Patch-Clamp-Technik, Aktivitäten an Ionenkanälen detektieren lassen.

Die Zell-Transistor Biosensorik – Versuchsbeschreibung

Für die neue Methode wurden die Zellen auf mikroelektronischen Halbleiterchips mit Transistoren kultiviert. Abbildung 1 zeigt schematisch den Aufbau des Assays. Zwischen Zelle und Chip liegt ein Spalt von 50 bis 70 Nanometern Höhe. Öffnen sich die Kanäle in der Zellmembran durch die Wirkung des Liganden, fließt ein Strom entlang dieses Spaltes in die Zelle. Der Strom erzeugt eine extrazelluläre Spannung VJ im Spalt. Diese moduliert wiederum den Source-Drain-Strom im Transistor und kann so detektiert werden. Vorteil dieses Ansatzes ist, dass er keine Fluoreszenzfarbstoffe oder ähnliche Sonden benötigt. Zudem sind Halbleiterchips und die entsprechende Verstärkerelektronik als Massenprodukte im Vergleich zu optischer Ausrüstung einfach und billig herzustellen. Ein weiterer wesentlicher Aspekt ist, dass die Zellen bei dieser Methode nicht kontaktiert werden. Das Verfahren ist somit nicht-invasiv. Dies verlängert die Lebensdauer der Zellen und damit auch den Zeitraum, in dem sie für Experimente genutzt werden können. Schließlich erreicht die heutige Halbleiter-Prozesstechnik bereits eine große Anzahl und Dichte an Transistoren pro Chip. Dadurch lassen sich viele Messungen parallel an einem Chip durchführen. Dieser Parallelisierungsgrad wird selbst von den Planar-Patch-Clamp-Geräten nicht erreicht.

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Der Beitrag beschreibt die Kopplung des Liganden-gesteuerten Ionenkanals 5-HT3A an Transistoren. 5-HT3A ist ein Rezeptor für den Neurotransmitter Serotonin. Dieser Botenstoff spielt eine wichtige Rolle im zentralen oder peripheren Nervensystem. Zur selben Klasse von Neurotransmitterrezeptoren gehören auch die Rezeptoren für Acetylcholin, gamma-Amino-Buttersäure und Glycin. Blocker für den 5-HT3A-Kanal werden zur Behandlung von Chemotherapie-induzierter Übelkeit und von Reizdarmbeschwerden eingesetzt.

Um kontrollierte Bedingungen zu schaffen, wird auch bei diesem Ansatz zunächst die Zelle mit einer Patch-Pipette kontaktiert. So kann die intrazelluläre Spannung VM vorgegeben werden. Außerdem lässt sich auf diese Weise der Membranstrom IM simultan zum Transistorsignal VJ messen. Serotoninlösungen werden mit einer Theta-Tube-Pipette und einem handelsüblichen Lösungswechselsystem appliziert. Für die Biosensoranwendung müssen kleine Membranströme ohne Mittelung wiederholter Messungen detektiert werden können. Dazu wurde ein Electrolyte-Oxide-Semiconductor-Transistor (EOS-Transistor) in einer speziellen Konfiguration entwickelt. In dieser so genannten Buried-Channel-Konfiguration liegt der leitfähige Kanal des Transistors (zwischen Source und Drain) einige Nanometer unter der isolierenden Oxidschicht an der Chipoberfläche. Das Hintergrundrauschen des Transistors ist dadurch gering und macht Mittelungen in den Experimenten unnötig.

Korrelation der Messergebnisse

Abbildung 2 zeigt Zellen, die den 5-HT3A-Kanal exprimieren. Die Zellen wurden auf einem Chip mit einem linearen Array von EOS-Transistoren kultiviert. Über einem Transistorgate wurde eine Zelle mithilfe einer Patch-Pipette kontaktiert. Während der Stimulation dieser Zelle mit Serotonin wurden simultan der Membranstrom IM mit der Patch-Elektrode und die Spaltspannung VJ mit dem Transistor aufgezeichnet. Zuvor wurde der Transistor mit einer Ag/AgCl-Elektrode in der Badlösung kalibriert.

Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse der Messungen für zwei verschiedene Serotoninlösungen. Die Pfeile markieren jeweils den Beginn der Serotonin-Stimulation. Die Spannung in der Zelle wurde auf einem konstanten Wert (VM = -120 mV) gehalten. Die Serotonin-Applikation löste negative Membranströme IM aus; gleichzeitig konnten mit dem Transistor die Spaltspannungen VJ gemessen werden, deren Verlauf dem Membranstrom entsprach. Die Amplituden und Zeitkonstanten hingen von der eingesetzten Serotonin-Konzentration ab. Trotz fortdauernder Serotonin-Applikation fallen die Signale sukzessive ab. Dieses Phänomen wird als Desensitivierung bezeichnet und ist eine charakteristische Eigenschaft dieser Kanäle. Konzentrationsabhängige Messungen wie in Abbildung 3 werden üblicherweise in einem Dose-Response-Plot ausgewertet. Dazu normiert man die Amplituden bei einer getesteten Konzentration auf die maximale Amplitude bei 100 µM Serotonin und trägt sie gegen die Konzentration auf.

Abbildung 4 zeigt den Dose-Response-Plot für IM und VJ. Für jede Konzentration wurden jeweils fünf Messungen durchgeführt. Alle Datenpunkte sowohl für IM als auch für VJ liegen auf einer Hill-Kurve, die in separaten Patch-Clamp-Experimenten ermittelt wurde. Es ergibt sich ein Hill-Koeffizienten n von 1,8 und eine halbmaximale Kanalaktivierung bei 4,2 µM Serotonin. Dies stimmt mit den bekannten Parametern für den 5-HT3A-Kanal überein.

Die Korrelation zwischen IM und VJ lässt sich weiter verdeutlichen, indem man beide Signale gegeneinander aufträgt. Alle Punkte liegen dann auf einer Geraden der Steigung 1, was eine perfekte Proportionalität zwischen Membranstrom und Spaltspannung anzeigt. Ein EOS-Transistor ist somit in der Lage, die Aktivität von 5-HT3A-Rezeptoren analog zur bisher üblichen Patch-Clamp-Technik zu detektieren und die Dosis-Wirkungs-Beziehung korrekt wieder zu geben.

Variabilität des Transistorsignals

Aufgrund der undefinierten Zellkultur auf der Oberfläche des Chips erfolgt die Positionierung der Zellen auf den Transistoren zufällig. Folglich können die Transistoren vollständig, halb oder nur zu einem Bruchteil von Zellen bedeckt sein. Daraus ergibt sich eine gewisse Variabilität der Messungen.

Der schmale Spalt zwischen Zelle und Chip wirkt als Widerstand, über den der Ionenstrom fließen muss. Nach dem Ohm‘schen Gesetz wird ein solcher Stromfluss in einen Spannungsabfall übersetzt, im vorliegenden Fall die messbare Spaltspannung VJ. Da die Geometrie des Zell-Chip-Kontaktes nicht gesteuert werden kann, ist im Spaltwiderstand neben dem elektrischen Schichtwiderstand des Zell-Chip-Kontaktes auch ein Geometriefaktor enthalten, der die unterschiedlichen Positionen des Transistors berücksichtigt. Die Variabilität des Zell-Chip-Kontaktes sollte sich also in den Spaltwiderständen der Zell-Chip-Kopplungen widerspiegeln. Die Spaltwiderstände von 16 Zell-Chip-Kopplungen wurden aus Wechselspannungsstimulationen der Zelle mit der Patch-Pipette bestimmt. Dabei wurde eine breite Variabilität von 50 bis 250 kOhm festgestellt.

Nach Korrelation dieser Messungen mit den Transistormessungen zeigt sich, dass der Spaltwiderstand in der Tat die Variabilität dominiert. Speziell der Geometriefaktor für die unterschiedlichen Positionen von Zelle und Transistor spielt hier eine große Rolle.

Schlussfolgerung

Die am MPI für Biochemie entwickelte Methode zeigt, wie ein liganden-gesteuerter Ionenkanal durch den Ionenstrom an einen Feldeffekt-Transistor gekoppelt werden kann. Damit ist ein grundlegendes Problem für die Rezeptor-Zell-Transistor Biosensorik gelöst. Ionenstrom und Spaltspannung verhalten sich proportional zueinander.

Für eine praktikable Anwendung verbleiben noch zwei wichtige Herausforderungen. Zum einen muss auf die bisher verwendete Patch-Pipette verzichtet werden. Wird die Spannung in der Zelle allerdings nicht mehr künstlich konstant gehalten, führt der Einstrom durch die Kanäle zu einem schnellen Zusammenbruch der Triebkraft. Auch wenn die Kanäle länger geöffnet sind, würde nur kurz ein kleiner Strom fließen, und ein Transistorsignal ließe sich nicht mehr detektieren. Statt einer Patch-Pipette könnte ein zweiter Ionenkanal in der Zelle mit entgegen gesetzter Stromrichtung den Einstrom kompensieren und so eine längere Triebkraft gewährleisten.

Des Weiteren muss die aus der zufälligen Zellkultur resultierende Variabilität der Kopplungen überwunden werden. Hier könnten Chips weiterhelfen, die über eine Vielzahl an Transistoren verfügen. Mittels CMOS-Prozesstechnik wurden bereits Chips mit über 16 000 Transistoren in einem dichten 2D-Array hergestellt und für Zellkulturen verwendet. Die statistische Auswertung einer großen Anzahl Zellen würde dann das Problem der auftretenden Variabilität lösen.

* Abteilung Membran- und Neurophysik, Max-Planck-Institut für Biochemie, 82152 Martinsried/München

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