LLE vs. SLE Zwei Flüssigextraktionen im Vergleich

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Die klassische Flüssig-Flüssig-Extraktion (engl. Liquid-Liquid Extraction, LLE) ist seit über 100 Jahren bewährt. Doch sie ist nicht zwangsläufig die beste Option. Oft ist die unterstützte Flüssigextraktion (engl. Supported Liquid Extraction, SLE) eine starke Alternative. Erfahren Sie warum.

Die Flüssig-Flüssig-Extraktion (engl. Liquid-Liquid Extraction, LLE) ist eines der ältesten, bis heute verwendeten Verfahren zur Probenvorbereitung. Sie wurde bereits 1909 in der Erdölindustrie entwickelt, um aromatische Kohlenwasserstoffe aus Kerosin zu entfernen [1]. Die zugrundeliegenden Prinzipien sind allgemein bekannt und die Anzahl an Veröffentlichungen macht es einfach, ein passendes Verfahren zu finden. Bei der LLE werden zwei verschiedene Lösungsmittelphasen verwendet, die sich nicht miteinander mischen – typischerweise eine wässrige Lösung und ein nicht mit Wasser mischbares Lösungsmittel (z. B. Dichlormethan, Hexan, Ethylacetat). Durch Schütteln werden die Analyten von einer Phase zur anderen gebracht, üblicherweise von einer wässrigen zu einer organischen Lösung. Die Effizienz, mit der dies geschieht, wird mit dem Verteilungskoeffizienten Kp bezeichnet (s. Textkasten unten: Der Verteilungskoeffizient).

Wegen der grundlegenden Prinzipien der Lösungsmittelseparation und der hohen Verfügbarkeit gängiger Lösungsmittel, Glasinstrumente und Geräte ist die LLE ein beliebtes Extraktionsverfahren in Chromatographielabors. Allerdings weist dieses Verfahren erhebliche Nachteile auf. Ein kritischer Aspekt ist das Schütteln des Zwei-Phasen-Gemisches, da es unabdingbar für eine effiziente Verteilung des Analyten zwischen den Phasen ist.

Durch das Schütteln wird der Oberflächenkontakt zwischen den beiden Lösungen wesentlich erhöht und der Transfer des Analyten von einer Phase zur anderen verbessert. Die unzureichende Vermischung der beiden Lösungen führt daher zu einem ineffizienten LLE- Verfahren. Andererseits kann zu starkes Schütteln die Bildung einer Emulsion zur Folge haben: Tröpfchen eines Lösungsmittels bilden sich im anderen, wenn als Tenside wirkende Verbindungen vorhanden sind. Das Tensid lässt die beiden Phasen miteinander interagieren, sodass eine Zwischenphase an der Oberflächengrenze entsteht.

Darüber hinaus gilt der Durchsatz bei der LLE als niedrig, da die Proben seriell anstatt parallel vorbereitet werden. Die einzelnen Schritte des LLE-Prozesses erfordern wiederholtes Schütteln und Lösungsmitteltransfer, wodurch sich die Anzahl der innerhalb eines bestimmten Zeitraums verarbeitbaren Proben verringert. Beide Schritte sind auch direkt abhängig vom Labornutzer und unterscheiden sich daher mitunter von Person zu Person im Ergebnis.

Extraktion mit Diatomeenerde

Ein alternatives, auf den gleichen Prinzipien wie die LLE beruhendes Verfahren zur Probenvorbereitung ist die unterstützte Flüssigextraktion (engl. Supported Liquid Extraction, SLE). Bei der SLE wird Diatomeenerde als Träger für den Trennungsprozess eingesetzt. Hierbei handelt es sich um ein natürliches, chemisch inertes, poröses Material mit einer großen Oberfläche. Dank dieser Eigenschaften lässt sich Wasser einfach durch Kapillarwirkung in die Diatomeenerde einbringen und an die Oberfläche der Diatomeenstrukturen adsorbieren. Der SLE-Prozess imitiert die LLE-Theorie, bei der zwei flüssige Phasen miteinander interagieren. Phase eins bildet sich, wenn die wässrige Lösung (Wasser, Plasma, Serum usw.) eingebracht und durch Kapillarwirkung für mehrere Minuten zum Fließen gebracht wird. Dadurch adsorbiert das Wasser an die Oberfläche der Diatomeenerde und bildet dort eine Phase mit einer großen Oberfläche. Die zweite Phase ist ein nicht mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel, das mittels Schwerkraftwirkung durch das Trägerbett hindurch geleitet wird. Wenn das Lösungsmittel an der wässrigen Phase vorbeifließt, bildet sich eine Verteilung mit einer äußerst effizienten Phasengrenzfläche, deren Wirkung dem Schütteln bei der LLE entspricht. Dies ermöglicht ein Aufreinigen der Probe, indem unerwünschte Verbindungen im adsorbierten Wasser gelöst bleiben. Dazu gehören Verbindungen wie Phospholipide oder polare Verunreinigungen.

Die SLE gilt im Vergleich zur LLE allgemein als Verfahren mit besserer Reproduzierbarkeit, bezogen auf Probe, Anwendung und Anwender. Sie eliminiert alle kritischen Schritte (Schütteln, manuelle Hand­habung und Durchsatz) der LLE. Dank effizienter Wechselwirkungen durch Lösungsmittelfluss unter Schwerkraftwirkung sind Schütteln und manuelles Abtrennen der Lösungsmittelschicht nicht mehr erforderlich. Die SLE lässt sich auch einfach durch Kombination von Mikrotiterplatten mit 96 Positionen und Probenahme-Robotern automatisieren, sodass eine hohe Anzahl von Proben an nur einem Tag verarbeitet und somit ein höherer Probendurchsatz erzielt werden kann. Welche Vorteile die SLE im Vergleich zur LLE in Bezug auf Zeit und Leistung hat, zeigt das folgende Anwendungsbeispiel.

Verfahren für die Probenvorbereitung

Details zu den LC-Bedingungen und den verwendeten Analyten des im Folgenden beschriebenen Verfahrens finden Sie in den Tabellen in der Online-Version dieses Artikels auf www.laborpraxis.de

Plasmapräparation: Drei separate Mengen Schweineplasma (Sigma-Aldrich) wurden auf 1 µg/ml mit basischen, sauren und neutralen Verbindungen aufkonzentriert und für 30 Minuten äquilibriert, bevor sie im SLE- und LLE-Verfahren eingesetzt wurden.

SLE: Nach dem Befüllen der Wells mit den jeweiligen Plasmaproben wurden die Proben mit verschiedenen Vorbehandlungslösungen verdünnt. Dies ändert den pH-Wert der Lösung, ermöglicht eine optimale Extraktion mit organischer Lösung bei der Elution und verdünnt die Proben für einen besseren Fluss auf die Platte. Für die Vorbehandlungslösungen wurden basische Verbindungen in 5%-iger, wässriger Ammoniaklösung und saure Verbindungen in 2%-iger, wässriger Ameisensäurelösung verdünnt; für neutrale Verbindungen wurde deionisiertes Wasser verwendet. Da sich der pH-Wert auf neutrale Verbindungen nicht auswirkt, wurde für eine optimale Wiederfindung Wasser zum Verdünnen der Probe verwendet, um einen besseren Fluss auf die Microlute SLE-Platte zu erreichen. 200 µl des verdünnten Plasmas (100 µl Schweineplasma + 100 µl Vorbehandlungslösung) wurden mit 0,21 bar (3 PSI) Überdruck für fünf Sekunden in die 200 mg Microlute-SLE-Platten eingebracht. Danach erfolgte ein Eintrag über fünf Minuten, um die Probe vollständig absorbieren zu lassen.

Zur Extraktion der Analyten aus dem SLE-Produkt wurden 2 x 500 µl des Lösungsmittels zu den einzelnen Wells hinzugegeben, gefolgt von der Elution unter Schwerkrafteinwirkung in eine Probennahmeplatte mit 1 ml. Nach Abschluss beider Elutionen wurden für 30 Sekunden 0,69 bar (10 PSI) Überdruck auf der Platte ausgelegt, um die Elution abzuschließen. Der Eluent wurde unter Einsatz von Stickstoff mit dem Porvair Sciences Ultravap Levante bei 35 °C eingedampft und die Probe in 200 µl mobiler Startphase aufgenommen.

LLE: Die LLE wurde mit Zentrifugenröhrchen mit 1,5 ml durchgeführt. 2 x 500 µl des Lösungsmittels wurden zu 200 ml verdünntem Plasma hinzugegeben (es erfolgte dieselbe Vorbehandlung wie bei der SLE). Für jede Extraktion wurden die Proben fünf Minuten lang von Hand geschüttelt und fünf Minuten lang bei 10.000 RZB zentrifugiert. Die organische Schicht wurde mit einer Glaspipette vorsichtig vom Röhrchen in eine Probennahmeplatte transferiert, unter Einsatz von Stickstoff mit dem Porvair Sciences Ultravap Levante bei 35 °C eingedampft und die Probe in 200 µl mobiler Startphase aufgenommen.

Ergebnisse und Diskussion

In den Abbildungen 2, 3 und 4 werden Chromatogramme basischer, saurer bzw. neutraler Analyten gezeigt. Eine Raptor-Biphenyl-Säule (30 mm x 2,1 mm, 1,8 µm) diente zur Trennung der drei Klassen von Verbindungen mittels dreier verschiedener chromatographischer Verfahren in jeweils weniger als zehn Minuten. Weitere Details in Tabelle 1 bis 5 in der Bildergalerie.

Bildergalerie

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Wiederfindung und Reproduzierbarkeit

Die Analytenwiederfindung wurde mit der folgenden Gleichung berechnet: Wiederfindung [%] = Peakfläche_(Probe) / Peakfläche_(Standard) x 100 %

Die Analytenreproduzierbarkeit wurde aus der relativen Standardabweichung bestimmt, die mit der folgenden Gleichung berechnet wurde: RSD [%] = (durchschnittliche Wiederfindung des Analyten) / Standardabweichung der Wiederfindungen) x 100 %

In Abbildung 5 werden die mittleren Wiederfindungsraten für SLE und LLE nebeneinander dargestellt. Die Microlute SLE zeigt verbesserte, reproduzierbare Wiederfindungsraten für Analyten aller Art (sauer, basisch und neutral). Die durchschnittliche Wiederfindungsrate aller getesteten Analyten betrug 94±6 %. Es wurden Wiederfindungsraten von 89 bis 106 % ermittelt. Bei der LLE waren die Wiederfindungsraten geringer, mit einem Durchschnitt von 87±7 %, wobei Wiederfindungsraten von 79 bis 98 % auftraten. Auch wenn es einige hohe Wiederfindungen gab, waren diese im Durchschnitt niedriger als bei der SLE, bei schlechterer Reproduzierbarkeit. Bei der LLE können die Wiederfindungsraten verbessert werden, indem eine dritte Extraktion der Probe vorgenommen wird. Dies würde allerdings keinen direkten Vergleich mit der SLE ergeben und den Zeitaufwand für die Probenvorbereitung weiter erhöhen. Es können auch Probleme durch das Einbringen von Matrixeffekten durch die Extraktion weiterer, unerwünschter Verbindungen entstehen, die sich auf die Ionisierung im System auswirken können.

Der Vergleich der beiden Techniken zeigt, dass die Wiederfindungsrate bei der SLE mindestens so gut oder besser ist als bei der LLE. Dies war bei allen Arten von Analyten – sauer, basisch und neutral – der Fall. Der Grund hierfür ist die höhere Extraktionseffizienz von Microlute SLE , die eine effektivere Lösung bietet, um eine höhere Wiederfindungsrate in kürzerer Zeit bei weniger repetitiven Schritten zu erhalten. Dies wird bei den stärker hydrophilen Verbindungen (Coffein, Procainamid und Acetaminophen) besonders deutlich, bei denen das SLE-Verfahren eine Steigerung der Wiederfindung um 10 bis 20 % bietet.

In Abbildung 6 werden die Ergebnisse für die Reproduzierbarkeit als relative Standardabweichung (%RSD) dargestellt. Je kleiner der %RSD-Wert, desto besser reproduzierbar ist die Wiederfindung. Die Reproduzierbarkeit ist ein wichtiges Maß für die Belastbarkeit von Ergebnissen. Bei guter Wiederfindung und gleichzeitiger schlechter Reproduzierbarkeit kann man sich die Frage stellen, ob das Ergebnis richtig war und erneut erzielt werden könnte. Der durchschnittliche %RSD-Wert für die SLE-Wiederfindungen betrug 3,2 %, mit Einzelwerten von 0,7 bis 6,9 %. Diese Werte ergaben eine bessere Reproduzierbarkeit für die SLE im Vergleich zur LLE mit einem Durchschnittswert von 4,8 % und Einzelwerten von 1,2 bis 12,5 %. Diese Differenz ergibt sich wahrscheinlich daraus, dass die LLE mehr Schritte aufweist, die auf der Technik des Analysepersonals beruhen, um von Probe zu Probe reproduzierbare Extraktionsschritte sicherzustellen – Schütteln gefolgt von der Extraktion der organischen Schicht.

Verarbeitungszeit

Ein weiterer Bereich, in dem die SLE die klassische Flüssig-Flüssig-Extraktion übertrifft, ist die Zeit, die für die Probenvorbereitung benötigt wird. In den Tabellen aus Abbildung 1 am Anfang des Beitrags wird die Differenz zwischen den Bearbeitungszeiten für die beiden Verfahren zur Probenvorbereitung dargestellt. Die Vorbereitung von 96 Plasmaproben für die SLE geschieht dreimal so schnell wie die Vorbereitung der gleichen Anzahl von Proben für die LLE (40 anstatt 129 Minuten). Die größte Zeit­ersparnis ergibt sich daraus, dass arbeitsintensive Schritte wie das Schütteln der Proben und der Transfer organischer Lösungsmittelschichten bei der SLE entfallen.

Zusammenfassung

Der Vergleich von klassischer Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE) und unterstützter Flüssigextraktion (SLE) zeigt, dass die Microlute SLE-Platte sowohl hinsichtlich der Leistung (höhere Wiederfindung und besser reproduzierbare Ergebnisse) als auch der für die Probenvorbereitung benötigten Zeit dem gleichwertig durchgeführten LLE-Verfahren überlegen ist. Mit den Microlute SLE-Platten von Porvair Sciences kann eine höhere Genauigkeit bei verlässlicheren Ergebnissen erzielt werden. Weil bei der SLE weniger arbeitsintensive Schritte nötig sind, lässt sich der Durchsatz der Methode im Vergleich zur LLE erhöhen und stellt somit eine sinnvolle Alternative zur klassischen Flüssig-Flüssig-Extraktion dar. (clu)

* J. Edwards, Applikationsspezialist Chromatographie,Porvair Sciences

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