CHROMATOGRAPHIE Aflatoxine mit LC/MS bestimmen

Automatisierung der Festphasenextraktion ermöglicht zuverlässige und verwertbare Messergebnisse in weniger als der Hälfte der bisher üblichen Zeit.

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Wer in Rohstoffen oder Lebensmitteln, insbesondere solchen, die für die Herstellung von Arzneimitteln und Babynahrung bestimmt sind, Schimmelpilzgifte, Mykotoxine, sicher und sensitiv bestimmen will, setzt auf die LC/MS nach vorangegangener Festphasenextraktion (SPE). Das garantiert die Einhaltung der vom Gesetzgeber festgelegten Nachweisgrenzen. Während das eigentliche Probenhandling im Vorfeld der LC/MS-Analyse von Aflatoxinen, den wirksamsten Mykotoxinen, nur begrenzt Spielraum für Optimierung bietet, lassen sich zuverlässige und verwertbare Messergebnisse in weniger als der Hälfte der bisher üblichen Zeit erreichen, wird die Festphasenextraktion automatisiert.Auch wenn die wohl sortierte Käsetheke vom Gegenteil überzeugen mag: Wer verschimmelte Lebensmittel verzehrt, die nicht Schimmelkäse sind, setzt seine Gesundheit aufs Spiel. Grund sind Mykotoxine, die beim Stoffwechsel bestimmter Schimmelpilze entstehen. Wie u. a. das Niedersächsische Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (Laves) beschreibt, wird ihnen eine chronische und akute Toxizität zugeschrieben. Diese wird durch krebserzeugende, erbgutverändernde und hormonaktive Eigenschaften hervorgerufen, die insbesondere für Säuglinge und Kleinkinder schädlich sind.

Natürliches Karzinogen birgt die größte GefahrWissenschaftlich beschrieben wurden bislang mehr als 300 Mykotoxine, die von rund 250 Schimmelpilzarten gebildet werden können. Für die Lebensmittelsicherheit bedeutend sind allerdings nur wenige Mykotoxine beziehungsweise Schimmelpilze. Dazu zählen die Gattung Aspergillus flavus und Aspergillus parasiticus, die vor allem unter feuchtwarmen Bedingungen auf öl- und stärkehaltigen Samen, Erd-, Wal- und Haselnüssen, Pistazien, Mandeln, Feigen, Kokos, Obst, Getreide, Reis, Mais und Soja sowie in Trockenfrüchten und Gewürzen gedeihen. Die vom Aspergillus flavus und Aspergillus parasiticus produzierten Aflatoxine B1, B2, G1 und G2 sowie M1 zählen zu den wirksamsten Mykotoxinen überhaupt. Aufgrund seines krebserregenden Potenzials geht vom Aflatoxin B1 die größte Gefahr aus. Aflatoxine sind fluoreszierende, heterozyklische Verbindungen, bestehend aus einer Dihydro- oder Tetrahydrofuranofuran-Einheit, die mit einem substituierten Cumarin-Ring verbunden ist. Die Gruppe der Aflatoxine umfasst mehr als 20 verschiedene Toxine. Relevant sind vor allem aber die Aflatoxine B1, B2, G1, und G2, wobei B1 am häufigsten ist. Aflatoxin M1, das unter anderem in Milch und Milchprodukten gefunden wird, entsteht im Verlauf des Stoffwechsels bei Tieren und Menschen, wenn sie zuvor Aflatoxin B1 über kontaminierte Nahrungs- beziehungsweise Futtermittel aufgenommen haben. Aflatoxin M1 ist in seiner Giftigkeit mit Aflatoxin B1 vergleichbar; die karzinogene Wirkung des M1 aber ist deutlich reduziert. Das Risiko einer akuten Vergiftung durch hohe Mykotoxinkonzentrationen ist aufgrund der allgemein guten Lebensmittelqualität in Deutschland laut Laves eher niedrig. Anders verhalte es sich in Afrika und Asien, wo der Verzehr verschimmelter Erdnüsse oder Maisprodukte, bedingt durch schlechte Wachstums-, Lagerungs- und Transportbedingungen, immer wieder zu akuten Aflatoxin-Vergiftungen mit Todesfällen führt. Die letale Aflatoxin-Dosis für einen Erwachsenen liegt laut Literatur bei 1 bis 10 mg pro Kilogramm Körpergewicht.Ubiquitäre Verteilung bedingt Höchstwerte„Die Mykotoxinkontamination von Lebens- und Futtermitteln ist ein weltweites Problem. Die UN Food and Agriculture Organization (FAO) schätzt, dass bis zu 25Prozent der Weltproduktion von Nahrungsmitteln mit Mykotoxinen kontaminiert sind. Etwa 20 Prozent der Cerealienernte der EU enthält messbare Mengen Mykotoxine. Über die Wirkung geringer Mengen oder einer Mischung von Mykotoxinen – vor allem bei lebenslanger Aufnahme – liegen dagegen kaum Erkenntnisse vor“, heißt es auf der Homepage des Bayerischen Staatsministeriums für Umwelt, Gesundheit und Verbraucherschutz. Aufgrund der Gesundheitsgefährdung, die von Schimmel ausgeht, und seiner natürlichen ubiquitären Verbreitung, hat der Gesetzgeber Grenz- beziehungsweise Höchstwerte für Mykotoxine im Bereich weniger Mikrogramm pro Kilogramm (µg/kg) festgelegt. Unter anderem gelten für Erdnüsse, Schalenfrüchte und Getreide, die für den direkten Verzehr oder als Lebensmittelzutat vorgesehen sind, zulässige Höchstmengen von 2 µg/kg Aflatoxin B1 beziehungsweise 4 µg/kg als Summenwert für B1, B2, G1 und G2. Der Wert für Aflatoxin M1 in Milch darf 0,05 µg/kg nicht überschreiten. Bei Nahrungsmitteln für Säuglinge und Kleinkinder begrenzt die Diätverordnung die zulässige Menge an Aflatoxin B1 auf 0,05 µg/kg, die für M1 auf 0,025 µg/kg.LC/MS für den sicheren und sensitiven NachweisMittel der Wahl zum sicheren und sensitiven Nachweis von Aflatoxinen ist die LC/MS nach vorangegangener spezifischer Festphasenextraktion (SPE) bzw. Affinitätschromatographie, was die Einhaltung der vom Gesetzgeber festgelegten Nachweisgrenzen gewährleistet. „Während das eigentliche Probenhandling im Vorfeld der LC/MS-Analyse von Aflatoxinen nur begrenzt Spielraum für Optimierung bietet“, erklärt Dr. Norbert Helle, Applikationsspezialist und Inhaber der Tela GmbH, einem Auftragslabor in Bremerhaven, „lassen sich zuverlässige und verwertbare Messergebnisse in weniger als der Hälfte der bisher üblichen Zeit erzielen, wird die Immunoaffinitätschromatographie an Festphasen-Kartuschen automatisiert.“ Helle hat eine LC/MS-Methode zum Nachweis der Aflatoxine B1, B2, G1 und G2 in Lebensmitteln, die zum Beispiel für Pistazien, Paprikagewürz und verschiedene Früchte geeignet ist, entwickelt. Die Aflatoxine B1 und G1 werden nach Aufreinigung mittels Immunoaffinitätschromatographie über Einwegkartuschen bromiert, sprich derivatisiert und ein Aliquot der Probe auf die LC-Säule aufgegeben.„Sämtliche Schritte der Probenvorbereitung, von der Zugabe des internen Standards über die SPE und Derivatisierung bis zur Probenaufgabe, verlaufen voll automatisiert“, erklärt der Applikationsexperte und ergänzt: „Durch die Software-gesteuerte Verschachtelung von Probenvorbereitung und Analyse besteht zu keinem Zeitpunkt das Risiko etwa eines Substanzverlustes oder unerwünschter chemischer Reaktionen, weil sämtliche Schritte der Probenvorbereitung – einschließlich Derivatisierung – sozusagen just-in-time erfolgen.“ Niedrige Nachweisgrenzen in kürzerer Zeit erreichenZur Derivatisierung versetzte der Chemiker den Probenextrakt mit einer Lösung elementaren Broms in Chloroform. Dr. Norbert Helle: „Dibromierte Komponenten waren nicht zu detektieren.“ Den Ergebnissen nach zu urteilen, sagt der Applikationsexperte, zeigen die erhaltenen monobromierten Aflatoxine längere Retentionszeiten in der Umkehrphasenchromatographie als nicht-bromierte Verbindungen, was unter anderem in einer besseren Trennung der vier Aflatoxine resultiert. Auch wird eine deutliche Minimierung von Interferenzen durch Matrixbe-standteile beobachtet. Wichtiger noch sei die Tatsache, das die Derivatisierung zu einer signifikant besseren MS-Response führe, verbunden mit einem charakteristischen Brom-Muster im Massenspektrum. Letztlich sei dies der Grund, sagt Dr. Nobert Helle, „warum wir die Nachweisgrenze für alle untersuchten Aflatoxine unter 0,01 µg/kg senken konnten.“ Helle gelangte zudem sehr viel schneller zu sensitiven, sicheren und aussagekräftigen Ergebnissen, als es herkömmlich der Fall sei: „Während die manuelle Aufarbeitung der Kartuschen bei acht Proben alles in allem etwa vier Stunden erfordert“, erklärt der Wissenschaftler, „betrug der Zeitaufwand unter Einsatz des MultiPurpose-Samplers MPS mit SPE-Option für die gleiche Anzahl an Proben gerade einmal 80 bis 95 Minuten, je nach verwendeter Kartusche.“ Dies bedeute eine Zeitersparnis von weit über 50 Prozent, beschreibt Helle die Vorteile dieser Methode.HintergrundSchimmelpilze und MykotoxinforschungSeit Alters her plagt sich der Mensch mit Schimmelpilzen und den Folgen seines Befalls: Im Alten Testament im 3. Buch Mose (Leviticus) finden sich bereits erste Hinweise über vermutlich mit Schimmel-pilzen kontaminierten Innenräumen und Gegenständen mit entsprechenden Hygienevorschriften. Im Mittelalter kam es zu regelrechten Epidemien, oft tödlich verlaufender Vergiftungen, nachdem man Rog-genbrot, das mit Mutterkornhaltigem Mehl hergestellt worden, gegessen hatte. Selbst Mitte des letzten Jahrhunderts starben noch tausende Menschen, nach dem sie Brot verzehrt hatten, das Pilzen der Gattung Fusarium anheim gefallen war. „Vergiftungen durch Schimmelpilztoxine sind seit langem bekannt und in großem Ausmaß über die letzten Jahrhunderte aufgetreten“, schildert Prof. Manfred Gareis von der Bundesanstalt für Ernährung und Le-bensmittel, Institut für Mikrobiologie und Toxikologie, in Kulmbach. Im Dunkeln blieben allerdings die kausalen Zusammenhänge zwischen den Krankheiten beziehungsweise Symptomen und den Auslösern. Erst ein Massensterben unter englischen Puten Ende in den 1960-er Jahren und der damit verbundene wirtschaftliche Verlust brachten die Wissenschaft in Wallung. Nachdem schließlich auch Enten, Fasane und andere Nutztiere an der als Turkey X bezeichneten mysteri-ösen Krankheit verwendet waren, erkannten Experten den Zusammenhang. Manfred Gareis: „Als Ursache wurden schließlich die hochgiftigen Stoffwechselprodukte des Schimmelpilzes Aspergillus flavus – die Aflatoxine – im Futter, brasilianischem Erdnussmehl, nachgewiesen.“ Der Grundstein für die Mykotoxinforschung war gelegt worden.*G. Deußing, ScienceCommunication, 41464 Neuss

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