Identische Kopien synthetisierter Peptid-Mikroarrays Peptidanalytik spot-on

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Die Analyse von Proteinwechselwirkungen ist eine zentrale Herausforderung in den Life Sciences. Statt der klassischen SPOT-Technik bietet sich eine alternative Methode an, mit der sich leicht Assays duplizieren lassen. Zwei Applikations- beispiele zeigen, was damit möglich ist: das spezifische Mapping von linear bindenden Epitopen sowie die Antikörperdetektion an Coronaviren.

Protein-Protein-Wechselwirkungen spielen eine Schlüsselrolle bei vielen biologischen Prozessen in lebenden Zellen und somit auch bei zahlreichen Erkrankungen. Daher ist es wichtig, die zugrundeliegenden Mechanismen bei der Interaktion von Proteinen zu verstehen und so im Idealfall neue Ansätze für Arzneimittel zu finden. Doch wie lässt sich die Beziehung von der Struktur eines Proteins und dessen Aktivität (SAR, structure-activity-relationship) studieren? Dazu kommt eine Vielzahl von Techniken in Frage. So nutzen Forscher etwa spezielle Peptide, mit deren Hilfe sie Proteininteraktionen analysieren.

Hier ist die so genannte die SPOT-Technik zu nennen. [1] Sie ermöglicht die parallele Synthese einer großen Anzahl an Peptiden auf planaren Zelluloseträgern, die kompatibel sind mit vielen Bindungs-, Enzym- und Zelltests. Die auf der Synthesemembran immobilisierten Peptide lassen sich leicht synthetisieren und ermöglichen SAR-Studien mit hohem Durchsatz. Arrays identifizieren Interaktionsstellen zwischen zwei Proteinen und helfen dabei, nach Peptiden zu screenen, die das Zielprotein binden.

Die SPOT-Methode: Vor- und Nachteile

Zentral für das Verständnis von Wechselwirkungen zwischen Proteinen ist die Kenntnis, an welchen Stellen ihrer Oberfläche (Epitope) sie eine Immunantwort auslösen. Hierfür eignen sich Peptidbibliotheken, die neben der Epitop-Kartierung auch für den Nachweis enzymatischer Aktivitäten sowie für die Identifizierung von Protein-Protein- und Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen genutzt werden. Um eine Ligandenbindungsstelle zu identifizieren, ist ein Scan einer Bibliothek überlappender, 10 bis 20 Aminosäuren langer Peptide nötig.

Im Gegensatz zu anderen biochemischen oder biophysikalischen Methoden für die Erkennung und Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungsstellen, erfordert das Protein-Screening mit der SPOT-Methode eine sehr geringe Proteinkonzentration. Kehrseite ist ihre begrenzte Wiederverwendbarkeit: Die Membran kann in einigen Assays nur einmal verwendet werden. Dementsprechend zeitaufwändig ist es, Duplikate der SPOT-Arrays mit identischer Qualität herzustellen. Darüber hinaus sind die Membranen im Vergleich zu Mikroarrays auf Glasobjektträgern groß und erfordern größere Volumina an Reagenzien.

Um diese Limitierungen zu umgehen, wurde Cellu Spots entwickelt. Diese Technik beseitigt die Nachteile der SPOT-Methode und behält gleichzeitig die Vorteile der klassischen SPOT-Membranen.

Arrays auf Celluloseträgern

Für die Herstellung von Cellu-Spots-Arrays werden die Peptide auf einem modifizierten Cellulose-Träger synthetisiert, der danach aufgelöst werden kann. In diesen Lösungen verbleiben die einzelnen Peptide kovalent an die makromolekulare Cellulose gebunden. Das Ergebnis sind Arrays von synthetisierten Peptid-Cellulose-Konjugaten, die auf einen Glasobjektträger übertragen werden. So können aus einer Synthese bis zu 500 Kopien auf Glasobjektträgern hergestellt werden.

Auf den Objektträgern bildet sich eine dreidimensionale Struktur mit einer um Zehnerpotenzen erhöhten Peptiddichte im Vergleich zur herkömmlichen SPOT-Membran aus. Dies verschiebt das Bindungsgleichgewicht in eine für Protein-Protein-Wechselwirkungen mit niedriger Bindungsaffinität günstige Richtung. Die direkte Synthese von Peptid-Bibliotheken auf einer funktionalisierten Oberfläche ist möglich, dennoch bietet das „Spotten“ von vorgefertigten Peptiden Flexibilität und Reproduzierbarkeit und ist preiswerter als die herkömmliche Methode. So lassen sich identische Kopien derselben oder verwandter Peptid-Arrays herstellen, die mit Probevolumen von weniger als 150 µl inkubiert werden können.

Im Folgenden werden zwei Anwendungsbeispiele für Cellu-Spots-Arrays beschrieben: Zum einen die Identifizierung von B-Zell-Epitopen bei Nahrungsmittelallergenen und zum anderen die Antikörper-Detektion am Beispiel einer stabilisierten Variante des Spike-Proteins von SARS-CoV-2.

IgE-bindende Epitope abbilden

Eine Nahrungsmittelallergie ist eine durch den Antikörper Immunglobulin E (IgE) vermittelte und potenziell lebensbedrohliche chronische immunologische Erkrankung und stellt ein erhebliches klinisches Problem in Europa dar. Erdnüsse und Sojabohnen gehören dabei zu den häufigsten Auslösern allergischer Reaktionen auf Nahrungsmittel. Die Identifizierung von B-Zell-Epitopen von Nahrungsmittelallergenen hat das Potenzial, zu neuen diagnostischen und therapeutischen Hilfsmitteln bei Nahrungsmittelallergien zu führen.

Detaillierte Informationen zu den häufigsten IgE-bindenden Epitopen eines Nahrungsmittelallergens können durch das Screening einer großen Anzahl Seren von individuellen Allergikern erhalten werden. Die Cellu Spots stellen eine flexible, einfache, kostengünstige und reproduzierbare Multipeptid-Mikroarray-Methode für die Forschung dar. Sie ermöglichen ein groß angelegtes Screening von IgE-Epitopen der Nahrungsmittelallergene. Die SPOT- und Cellu-Spots-Arrays identifizierten die IgE-bindenden Epitope mit einer Reproduzierbarkeit von 98 Prozent. Dabei wurde gegenüber der SPOT-Membran die Empfindlichkeit um das 2- bis 20-fache erhöht, und die benötigte Menge an Humanserum gegenüber der SPOT-Membran um zwei Drittel reduziert. Die Peptide wurden auf einer Cellulose-Disk als überlappende Peptide (15 Aminosäuren, Versatz von vier Aminosäuren) synthetisiert und repräsentierten die Primärsequenz der reifen Erdnussformen (Allergen Ara h 1) und die drei Untereinheiten des homologen Sojaallergens (Gly m 5). [2]

Antikörperdetektion an Coronaviren

Der schwerste Teil der Corona-Pandemie ist mittlerweile überstanden. Doch weiterhin hat die Erforschung des Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) hohe Relevanz. Nach Ausbruch der Pandemie 2019 wurden verschiedene Impfstoffe entwickelt, die auf einer stabilisierten Variante des Spike-Proteins des Virus basierten. Dies wirft die Frage auf, ob die Immunantwort gegen den stabilisierten Spike identisch ist mit der Immunantwort, die bei einem SARS-CoV-2 durch den nativen Spike hervorgerufen wird. Mithilfe eines Peptid-Arrays wurden die Bindungen von Antikörpern analysiert. Insgesamt wurden 253 15-mer-lange Peptide mit einem Versatz von fünf Aminosäuren zur Analyse der linearen Epitope von Spike-spezifischen Antikörpern synthetisiert. Hierzu wurden die Seren von Geimpften, Genesenen und Kontrollpersonen eingesetzt und die Cellulose-konjugierten Peptide mithilfe der Cellu Spots synthetisiert. Insgesamt wurden 37 lineare Epitope identifiziert, 26 davon ausschließlich durch Rekonvaleszenzseren.

In der beschriebenen Studie wurde festgestellt, dass die Antikörper von mit „Comirnaty“ geimpften Personen weniger lineare Epitope erkennen als die Antikörper von Rekonvaleszenten. Dies ist der Fall, obwohl der Antikörpertiter der mit Comirnaty erzeugten Seren höher ist als der Titer der Seren von Rekonvaleszenten. Der Grund für diesen Unterschied könnte in der Stabilisierung des Spike-Proteins liegen. Dies weist auf eine höhere Spike-spezifische Antikörperdiversität in Rekonvaleszenzseren hin. [3]

Fazit

Die Cellu-Spots-Peptid-Arrays sind vielseitige Werkzeuge für das immunologische Screening. Diese Arrays bieten die Möglichkeit, Interaktionen von Antikörpern, Proteinen und anderen Bindungspartnern an Peptiden zu analysieren. Sie erlauben ein paralleles Screening auf identischen Kopien eines Arrays, der mit den gängigsten Detektionsverfahren analysiert werden kann. Im Vergleich zur herkömmlichen SPOT-Analyse erlauben sie ein geringes Probenvolumen bei hoher Peptidbeladung. Zudem gelingt ein paralleles Testen vieler verschiedener Proben sowie das Erstellen von Array-Duplikaten mit identischer Qualität.

Literatur

[1] Ronald Frank: The SPOT synthesis technique - Synthetic peptide arrays on membrane supports - principles and applications, Journal of Immunological Methods, Volume 267, Issue 1, 1 September 2002, Pages 13-26, DOI: 10.1016/S0022-1759(02)00137-0

[2] Yvonne Kühne, Gerald Reese, Barbara K. Ballmer-Weber, Bodo Niggemann, Kay-Martin Hanschmann, Stefan Vieths, Thomas Holzhauser: A Novel Multipeptide Microarray for the Specific and Sensitive Mapping of Linear IgE-Binding Epitopes of Food Allergens, International Archives of Allergy and Immunology 2015; 166: 213–224, DOI: 10.1159/000381344

[3] Sascha Hein, Nuka Ivalu Benz, Jonathan Eisert, Marie-Luise Herrlein, Doris Oberle, Michael Dreher, Julia C. Stingl, Christoph Hildt and Eberhard Hildt: Comirnaty-Elicited and Convalescent Sera Recognize Different Spike Epitopes, Vaccines 2021, 9, 1419; DOI: 10.3390/vaccines9121419

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