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Allergene Chemikalien in der Lunge: Allergene aufspüren

Autor / Redakteur: Katherina Sewald* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Derzeit sind Tierversuche die einzige Möglichkeit herauszufinden, ob eine Chemikalie Allergien verursachen kann oder nicht. Forscher des Fraunhofer ITEM entwickeln jetzt eine Alternative, mit der das Aufspüren von Allergenen in vitro möglich werden soll.

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Abb. 1 PCLS-Präparation mit einem Krumdieck Tissue Slicer.
Abb. 1 PCLS-Präparation mit einem Krumdieck Tissue Slicer.
( Archiv: Vogel Business Media )

Atmen wollen, aber nicht können: reagieren unsere Lungen auf harmlose Substanzen mit einer heftigen Abwehr, nennt man die überschießende Immunreaktion allergisches Asthma. Dabei kommt es zu einer Verengung und Entzündung der Atemwege bis in die feinsten Luftwege und Lungenbläschen (Bronchiolen und Alveolen) und zu bronchialer Hyperreagibilität, wie die Überempfindlichkeit auf unspezifische Reize, z.B. kalte Luft, auch bezeichnet wird. Seit Jahren steigt die Häufigkeit von allergischem Asthma bronchiale und weiteren bedrohlichen Atemwegserkrankungen steil an.

Chemikalien, die als Allergene wirken können, lauern in unserem Alltag in Kosmetik, Waschmitteln und am Arbeitsplatz. Bisher sind umfangreiche Tierversuche in Inhalationsstudien mit z.B. Mäusen und Ratten nötig, um Atemwegsallergene aufzuspüren. Die Experimente werden am lebenden Tier durchgeführt und sind mit einer Belastung für die Tiere verbunden. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit zur Entwicklung alternativer Methoden, die eine Grundlage für die Risikobewertung von Chemikalien bilden können.

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Vitale Lungenschnitte (Precision cut lung slices, PCLS) stellen eine solche Alternativmethode im Sinne des 3R-Konzepts dar (s. Hintergrundtext). Aus diesem Grund gab es schon mehrere Auszeichnungen für die PCLS: 1997 den Europäischen Preis der Internationalen Stiftung für Alternativ-Methoden (FISEA) und ein Jahr später den Schleswig-Holstein-Tierschutzpreis für die Gruppe von Prof. Dr. Stefan Uhlig in Aachen, der die Methode für pharmakologische Fragestellungen entwickelt hat.

Die Technik der vitalen Lungenschnitte (PCLS) im Detail

Das Organ Lunge besitzt keine feste Eigenform und hat eine sehr weiche Konsistenz. In einem speziellen Verfahren muss die Lungenfestigkeit erhöht werden, damit das Gewebe mit einem Mikrotom präzise und fein geschnitten werden kann (s. Abb. 1). Die auf diese Weise gewonnenen PCLS werden im Labor kultiviert. Somit kann mit Lungenschnitten wie mit Zellkulturen gearbeitet werden, was den Umgang stark vereinfacht. PCLS weisen eine vollständige Vitalität und Funktionalität für mindestens 24 Stunden unter normalen Zellkulturbedingungen auf (s. Abb. 2).

Vitale Lungenschnitte als Alternative zum Tierversuch

Wissenschaftler am Fraunhofer Institut für Toxikologie und Experimentelle Medizin ITEM in Hannover arbeiten innerhalb des EU-Projekts „Sens-it-iv“ an Verfahren, die in Zukunft Tierversuche reduzieren sollen. In PCLS wird untersucht, ob Allergene im lebenden Gewebe Immunreaktionen auslösen. Dabei werden Zellen, Eiweiße und Gene analysiert, von denen bekannt ist, dass sie eine Rolle im allergischen Geschehen spielen können. Die Frage lautet: Welche Zellen und Mechanismen werden durch inhalierte Chemikalien aktiviert, und kommt es zu einer Antwort des Immunsystems?

Reaktion von PCLS auf Endotoxine und sensibilisierende Verbindungen

Noch werden die PCLS mit bekannten Allergenen und Modellnoxen wie Endotoxinen behandelt. Dabei haben Endotoxine und Allergene eins gemeinsam: sie stimulieren das Immunsystem.

Endotoxine sind Bestandteile von gramnegativen Bakterien. Sie sind allgegenwärtig und spielen eine große Rolle bei der Induktion von Entzündungsreaktionen. Im Labor werden sie oft in akuten Entzündungsmodellen verwendet, um zu demonstrieren, dass ein Immunsystem in der Lage ist, auf bestimmte Stimuli zu reagieren.

Endotoxine stimulieren in PCLS die Ausschüttung von Faktoren wie den proinflammatorischen Zytokinen TNFα und Interleukin-1 (s. Abb. 3). Das sind Proteine, von denen bekannt ist, dass sie im Menschen lokale Entzündungsprozesse in Gang setzen können. Damit entspricht die Wirkung von Endotoxin in PCLS in wesentlichen Zügen der in-vivo-Situation in Mensch und Tier. Das Medikament Dexamethason, das vielen Asthmatikern hilft, unterdrückt in PCLS, genauso wie im lebenden Patienten, die Produktion solcher Eiweiße. Schließlich versteht sich eine Immunreaktion als Balance aus schützender Immunaktivierung und deren gleichzeitigen Eindämmung. Im nächsten Schritt wurden ausgewählte Allergene eingesetzt, um ein Gefühl für die Reaktivität der PCLS zu erhalten. Diese Chemikalien umfassten respiratorische Allergene, die über Einatmen eine Sensibilisierung bewirken, und Kontaktallergene, die vor allem über die Haut als Aufnahmeroute eine Allergie hervorrufen. Ist es möglich, zwischen Kontaktallergenen und respiratorischen Allergenen zu unterscheiden, und ist es möglich, ein allergenes Potenzial einer Chemikalie für den Menschen vorherzusagen? Beispiele für solche Chemikalien schließen Säureanhydride, einige Diisocyanate, Platinsalze und reaktive Farbstoffe ein. So zeigten beispielhaft nicht-toxische Mengen von Platinverbindungen in PCLS eine Wirkung auf die Ausschüttung von TNFα und Interleukin-1 – eine Reaktion, die mit Kontrollverbindungen wie Phenol nicht zu finden war.

PCLS zeigen Aktivität und Motilität von dendritischen Zellen

Makrophagen und Dendritische Zellen (DCs) spielen eine wichtige Rolle im Rahmen jeder Entzündung. Normalerweise sind diese Zellen locker im Gewebe verteilt. Bei Immun- und Abwehrprozessen werden sie aktiviert und präsentieren auf ihrer Oberfläche Moleküle wie MHC-Klasse-II-Proteine, um weitere Immunreaktionen zu steuern. Detaillierte Analysen von Makrophagen und DCs in situ mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie bestätigen Veränderungen im Muster solcher Oberflächenproteine. In PCLS lassen sich Zellen identifizieren, die zum Beispiel MHC II, CD40, CD11c, aber nicht CD86 exprimieren. Dabei handelt es sich um Moleküle, die alle eine zentrale Rolle im Immun- und Allergiegeschehen spielen.

PCLS spiegeln somit das komplexe Zusammenspiel verschiedener Zelltypen im lebenden Organ wider. Bioimaging mit konfokaler Mikroskopie ermöglicht zudem, Motilität und Aktivität von DCs im dreidimensionalen Gewebe zeitaufgelöst aufzuzeichnen.

Transfer von murinen auf humane Lungen

Mit der Methode, so hoffen die Wissenschaftler, soll in Zukunft das sensibilisierende Potenzial inhalierter Stoffe ohne Tierversuche einfach abgeschätzt werden können. Dabei gelingt es zwar noch nicht, Tierversuche ganz zu vermeiden, wohl aber, sie zu reduzieren (Reduction, lt. 3R-Konzept, s. Kasten „Hintergrund: 3R-Konzept“).

Zudem sollen in einem nächsten Schritt die bisher gewonnenen Erkenntnisse demnächst auf humanes Material übertragen werden. Vielleicht können vitale Lungenschnitte in naher Zukunft als Alternative zu Tierversuchen in der immuntoxikologischen Bewertung von Chemikalien genutzt werden.

Hintergrund: 3R-Konzept – Tierversuche vermeiden

Das 3R-Konzept nach Russel und Burch (1959) versteht als Alternativmethoden Testverfahren, die dazu beitragen, Tierversuche entweder vollständig zu vermeiden (Replacement) oder wenigstens die Anzahl der verwendeten Tiere zu reduzieren (Reduction) und die Belastung für die Tiere zu vermindern (Refinement). Experimente an Tieren werden in diversen Rechtsvorschriften gefordert und spielen vor allem bei Prüfungen für die Anmeldung und Zulassung von Stoffen, Chemikalien und Produkten eine Rolle. Auf absehbare Zeit wird auf eine Reihe von Tierversuchen nicht verzichtet werden können.

Hintergrund: Zytokine – Proteine regulieren

Zytokine sind kleine lösliche Proteine, die von verschiedenen Zellen, vor allem aber von Immunzellen (zum Beispiel Makrophagen und T-Zellen) ausgeschüttet werden und vielfältige regulierende Aufgaben ausüben. Sie haben vor allem proinflammatorische und immunregulatorische Funktionen. Sie steuern unter anderem Entzündungszellen und können auch als Wachstumsfaktoren wirken. Aufgrund ihrer Struktur werden sie in verschiedene Familien eingeteilt. Es gibt die Hämatopoetine, zu denen Wachstumshormone und zahlreiche Interleukine (IL) gehören, Interferone, Chemokine und die TNF-Familie, mit TNFα als offensichtlichsten Vertreter dieser Familie.

Die Autorin

Katherina Sewald: Biochemie-Studium von 1998 bis 2001 an der Universität Leipzig; Promotion in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. P. Welzel; Postdoc bei Prof. A. Pühler in Bielefeld und Medizinstudium in Bochum; seit 2004 Mitarbeiterin der Arbeitsgruppe von Dr. A. Braun im Fraunhofer ITEM in Hannover; Forschungsschwerpunkt: Etablierung von Alternativen zu üblichen Tiermodellen in der Immuntoxikologie.

*Fraunhofer Institut Toxikologie und Experimentelle Medizin (ITEM), 30625 Hannover

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