Das richtige Reinstwasser für die HPLC-SEC-Analytik

Anbieter zum Thema

Sartorius AG

Mettler-Toledo GmbH

Shimadzu Deutschland GmbH

TOSOH Bioscience GmbH

Vorversuche mit Reinstwasser und Puffersubstanzen

In Vorversuchen wurde die Brauchbarkeit des eingesetzten Reinstwassers für die SEC-Analytik überprüft. Das Reinstwasser wurde wie in [5] beschrieben hergestellt und sowohl für die Vorversuche als auch für die weiteren Tests zur Bestimmung von Aggregatzuständen von monoklonalen Antikörpern verwendet. In den Vorversuchen sollte geklärt werden, ob das verwendete Arium Pro VF (ein Vorgängermodell mit den gleichen technischen Spezifikationen zur Reinstwasserproduktion wie das aktuelle System, s. Seite 38) für die SEC-Analytik bei der Bestimmung von Aggregaten und Monomer eines monoklonalen Antikörpers eingesetzt werden kann. Weiterhin wurde der Einfluss verschiedener Puffersubstanzen getestet.

Die eingesetzten Geräte und Materialien sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Die verwendete Phenomenex-Säule Yarra SEC 3000 (3 µm), ist eine mit modifiziertem Kiesel gefüllte SEC-Säule. Die Modifizierung des hochreinen Kieselgels neuer Generation sorgt für eine minimierte Adsorption von Proteinen, was für eine sehr gute Wiederfindung und verlässliche Quantifizierung unabdingbar ist. Das Material in der verwendeten Yarra-Säule hat eine Porengröße von 290 Å. Dies ermöglicht einen linearen Bereich für native Proteine zwischen 5 und 700 kDa [6].

Zur Bestimmung der Reinheit des Reinstwassers wurde dieses mit und ohne Zugabe von Puffersubstanzen injiziert. Die Puffersubstanzen wurden wie folgt in Reinstwasser angesetzt:

• TE = 1 % 1 M TRIS, 0,2 % 0,5 M EDTA, 0,01 % SDS pH 8, Leitfähigkeit 1,4 mS/cm

• Citrat = 20 mM Citronensäure Monohydrat pH 3,6 Leitfähigkeit 1,7 mS/cm

• Natriumphosphat/Natriumsulfat = 0,1 M Natriumphosphat/Natriumsulfat pH 6,6 Leitfähigkeit 23 mS/cm sowie

• Arium VF-Reinstwasser ohne Zusätze als Kontrolle.

Die Chromatogramme der SEC-Analytik wurden aufgenommen (s. Abb. 1) und zeigen, dass das verwendete Reinstwasser keinerlei Wechselwirkung mit der stationären Phase eingeht.

Die Zugabe von 0,1 M Natriumphosphat/Natriumsulfat für die mobile Phase zeigt ebenfalls einen geraden Basislinienverlauf ohne Peaks. Im Gegensatz dazu zeigt die Zugabe von Citrat und TE, dass hier Verunreinigungen beziehungsweise Substanzen enthalten sind, die Wechselwirkungen mit der Säule eingehen und sich in Peaks äußern und dadurch das eigentliche Chromatogramm verfälschen können.

Bildergalerie

Nachdem mit Vorversuchen geklärt wurde, dass das Arium Pro VF-Reinstwasser als Lösemittel für die Puffersubstanzen des Laufpuffers verwendet werden kann, wurde die eigentliche Analytik der Proben durchgeführt. Um bei der SEC-Analyse reproduzierbare Resultate zu erzielen, sind stets frisch hergestellte Fließmittel zu verwenden. Der pH-Wert und die Ionenstärke müssen auf die vorliegenden Proben optimiert werden [1]. Vor dem Aufbewahren der Säule sollte man diese zunächst mit Laufpuffer und dann mit Wasser, das 0,05% Natriumazid enthält, spülen und die Säule in diesem Zustand aufbewahren [1]. Die für die Säule verwendete mobile Phase (0,1 M Natriumphosphat /0,1 M Natriumsulfat, pH 6,6, Leitfähigkeit 23mS/cm) ist in Arium Pro VF-Reinstwasser, das eine ursprüngliche Leit-​fähigkeit von 0,055 µS/cm oder 18,2 MOhm, kompensiert auf 25 °C hatte, angesetzt. Die SEC-HPLC wird mit den in Tabelle 2 aufgelisteten Einstellungen/Parametern gefahren.

Zum Spülen nach Gebrauch und zur Lagerung der Säule wird Arium Pro VF-Reinstwasser + 0,05 % Azid eingesetzt. Beide Lösungen werden zur Vorbereitung für die HPLC-SEC durch Fil­tration über eine Sartolab BT 500 bottle top 0,2 µm Vakuumfiltrationseinheit entgast. Zur Probenvorbereitung werden die zu injizierenden Proben über Sartorius Minisart RC4 (17821, 0,2 µm) vorfiltriert und in Vials (Wicom WIC 42000) abgefüllt.

Durchführung des Tests und Ergebnisse

Säule und Vorsäule werden mit der mobilen Phase bei 1 ml/min bis zum Erreichen der Basislinie gespült. Mittels UV-Detektor wird die Absorption bei einer Wellenlänge von 220, 260 und 280 nm in Milli-Absorptionseinheiten (mAU) aufgenommen. Die Trennleistung der Säule wird mit Proteinen bekannter Größe getestet (s. Abb. 2 und Tab. 3).

Anhand der logarithmierten Molekülgrößen der Standardproteine und der ermittelten Retentionszeiten lässt sich eine Standardgerade erstellen, die die Berechnung unbekannter Proben anhand ihrer Retentionszeiten zulässt.

Bildergalerie

Die Trennleistung der Säule wird regelmäßig mit dem Standardproteingemisch überprüft. Beeinflusst wird die Trennleistung durch die Reinheit der Pufferzusätze des Laufmittels, Wechselwirkung des Laufmittels mit der Säule sowie der Zusammensetzung der zu analysierenden Proben. Die eingesetzten Puffer dürfen keine Wechselwirkung mit der stationären Phase eingehen. Die SEC-Analytik findet ihren Einsatz in der Qualitätskontrolle und wird ebenso bei der Optimierung und Entwicklung von Aufreinigungsprozessen eingesetzt.

(ID:43907826)