Worldwide China

Reinstwasser

Das richtige Reinstwasser für die HPLC-SEC-Analytik

| Autor / Redakteur: Katrin Töppner*, Dirk Hansen** und Elmar Herbig*** / Marc Platthaus

Abb.1: Das aktuelle Arium Pro VF Reinstwasser-System (l.); mit einem Vorgängermodell wurden die vorliegenden Untersuchungen durchgeführt.
Abb.1: Das aktuelle Arium Pro VF Reinstwasser-System (l.); mit einem Vorgängermodell wurden die vorliegenden Untersuchungen durchgeführt. (Bild: Sartorius)

Um die Reinheit von Biopolymeren zu bestimmen, wird oftmals die Size Exclusion Chromatography (SEC) eingesetzt. Lesen Sie, wie die SEC für die qualitative Untersuchung eines monoklonalen Antikörpers während eines Downstream-Prozesses genutzt wird.

Die HPLC (High Performance Liquid Chromatography) ist ein analytisches Verfahren zur Trennung, Identifizierung und Quantifizierung mittels Flüssigkeitschromatographie. Im Gegensatz zu anderen Varianten der HPLC von Biopolymeren (Ionenaustausch-, hydrophobe Interaktions-, Umkehrphasen-Chromatographie), die alle im Gradien­tenmodus betrieben werden, ist die SEC (Size Exclusion Chromatography = Größenausschlusschromatographie) gemeinhin eine isokratische Methode [1].

In der Größenausschlusschromatographie (SEC), wozu die Gelpermeationschromatographie (Gel Permeation Chromatography = GPC) und die Gelfiltration (eine spezielle Form der SEC unter wässrigen Bedingungen) zählen, arbeitet man mit porösen Partikeln als stationäre Phase. Kleine Moleküle können in die Poren eindringen und werden deshalb retentiert, wogegen sehr große Moleküle ausgeschlossen werden und mit der Lineargeschwindigkeit die Säule durchströmen. Die Trennung erfolgt also nach der Molekülgröße, wobei große Moleküle zuerst und kleine Moleküle später die Säule verlassen [2].

Bei dieser Methode wird mit konstanter Fließmittelzusammensetzung gearbeitet. Um enthalpische Effekte in der SEC minimal zu halten, wird ein starkes Fließmittel entsprechend einer hohen Fließmittelstärke (Elutionsstärke) benutzt. In der SEC ist dies in aller Regel ein Puffer mit eingestelltem pH-Wert und Salzzusatz. Um die Methode erfolgreich anzuwenden, ist eine SEC-Säule zu wählen, die zur Lösung des entsprechenden Problems geeignet ist. Der Weg zum Erfolg liegt dann in der Auswahl eines geeigneten Fließmittels, eines optimalen Flusses, des Injektionsvolumens und der Dosierkonzentration sowie in der Behandlung der Säule, sowohl beim Betrieb als auch der „außerbetrieblichen“ Handhabung (Regeneration und Aufbewahrung) [1].

SEC – bioanalytisch häufig eingesetzt

Die SEC ist eine häufig angewandte Trennmethode für Biopolymere. Aktuelle Anwendungsfelder sind:

  • Bestimmung des Molekulargewichtes z.B. von Antikörpern (Immunglobulin G, s. Bild S. 38), Peptiden und Proteinen,
  • Werkzeug zum Studium von Konformitätsänderungen,
  • nachgelagerte Produktaufbereitung und -reinigung (downstream processing) und eine spezielle Anwendung von SEC-Säulen mit eingeschränkter Zugänglichkeit, so genannte Restricted-Access-Säulen für die automatisierte Probenaufbereitung von Peptid- und Proteingemischen [1].

Proteinarzneistoffe haben in den letzten Jahrzehnten eine wichtige Position auf dem Arzneimittelmarkt erreicht. Zu diesen Biopharmazeutika gehören unter anderem therapeutische Enzyme, Gerinnungsfaktoren, zahlreiche Hormone wie Insulin, Epoetin oder Wachstumshormone, monoklonale Antikörper (mAB), sowie biotechnologisch hergestellte Impfstoffe [3].

Bei der rekombinanten Herstellung therapeutischer Proteine und Antikörper in der biotechnologischen Produktion ist die SEC-Analytik im Downstream-Prozess (Aufreinigung) eine Standardmethode zur Bestimmung von Reinheit und Aggregatzuständen des Zielmoleküls.

Die Bestimmung von Molekulargewichtsunterschieden zum Nachweis von Verunreinigungen und Aggregaten basiert auf der Nutzung von hochreinen Laufmitteln (mobile Phase), die keinerlei Wechselwirkung mit der stationären Phase eingehen.

Wasser speziell zur SEC mit der entsprechenden Qualität kann bei diversen Herstellern gekauft werden oder durch ein Wasseraufbereitungssystem z.B. dem Arium Pro VF-System direkt vor Ort und nach Bedarf kostengünstig hergestellt werden.

Als Beispiel für den Einsatz der SEC-Analytik ist hier die qualitative Untersuchung eines rekombinant hergestellten monoklonalen Antikörpers aufgeführt. Die verwendete Lösung stammt aus hauseigener Produktion. Die während des Upstream-Prozesses (Herstellung von Lösungen) entstehenden Verunreinigungen aus dem Fermentationsmedium (Host Cell DNA, Host Cell Proteine, Komponenten des Mediums wie Albumine, Insulin und Transferrin), sowie Keime und Endotoxine müssen im Verlauf des Downstream-Prozesses verringert werden. Hierbei ergeben sich Verunreinigungen (Zugabe von Proteasen, Leakage Protein A). Das Produkt selbst bildet Verunreinigungen in Form von gespaltenen, aggregierten Antikörpern, deamidierten oder oxidierten Formen des Antikörpers oder nicht korrekt gefalteten Molekülen [4], die beobachtet werden müssen.

Zur Qualitätskontrolle der Reinheit des Zielproteins wird unter anderem die SEC-Analytik zum Nachweis von aggregierten Antikörpern über Molekulargewichtstrennung verwendet.

Inhalt des Artikels:

Kommentare werden geladen....

Kommentar zu diesem Artikel abgeben

Der Kommentar wird durch einen Redakteur geprüft und in Kürze freigeschaltet.

  1. Avatar
    Avatar
    Bearbeitet von am
    Bearbeitet von am
    1. Avatar
      Avatar
      Bearbeitet von am
      Bearbeitet von am

Kommentare werden geladen....

Kommentar melden

Melden Sie diesen Kommentar, wenn dieser nicht den Richtlinien entspricht.

Kommentar Freigeben

Der untenstehende Text wird an den Kommentator gesendet, falls dieser eine Email-hinterlegt hat.

Freigabe entfernen

Der untenstehende Text wird an den Kommentator gesendet, falls dieser eine Email-hinterlegt hat.

copyright

Dieser Beitrag ist urheberrechtlich geschützt. Sie wollen ihn für Ihre Zwecke verwenden? Infos finden Sie unter www.mycontentfactory.de (ID: 43907826 / Chromatographie)