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Lichtstreuung

Dynamische Lichtstreuung im Labor einsetzen

| Autor/ Redakteur: Christian Ackerschott* und Marc Schneider* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Die dynamische Lichtstreuung (DLS) ermöglicht die Bestimmung des hydrodynamischen Radius von Proteinen, Biomolekülen und Nanopartikeln. Sie kann im Rahmen der Proteinkristallisation zur Analyse der optimalen Kristallisationsbedingungen eingesetzt werden. Wyatt bietet ein Plattenlesegerät, mit dem sich DLS-Messungen auch im Hochdurchsatz durchführen lassen.

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1 Mit der dynamischen Lichtstreuung (DLS) lassen sich Größen und Radien gelöster Proteine und anderer Biomoleküle bestimmen.
1 Mit der dynamischen Lichtstreuung (DLS) lassen sich Größen und Radien gelöster Proteine und anderer Biomoleküle bestimmen.
( Archiv: Vogel Business Media )

Seit den späten 1980er Jahren werden Detektoren für dynamische Lichtstreuung (DLS) kommerziell im Labor eingesetzt. Größen und Radien gelöster Proteine und anderer Biomoleküle lassen sich mit dieser Technologie in kleinen Volumina und niedrigen Konzentrationen bestimmen, ohne dabei die Probe zu zerstören. Auch Fragen zu Stabilität, Aggregation, Komplexbildung und Konformation von Molekülen lassen sich so beantworten.

Theorie der DLS

Bei der dynamischen Lichtstreuung betrachtet man die Intensitätsveränderung des von den Molekülen einer Probe emittierten Streulichtes als eine Funktion der Zeit. Bei der Lichtstreuung durch einen solchen Partikel wird ein Teil des einfallenden, polarisierten Lichtes gestreut und kann von Detektoren gemessen werden. Weil alle Teilchen in Lösung der Brownschen Molekularbewegung unterliegen, diffundieren sie ständig. In Relation zum Detektor kommt es dadurch zu Interferenzen, die sich konstruktiv (sich gegenseitig verstärkend) oder destruktiv (sich gegenseitig auslöschend) auf die Intensität des Streulichtes auswirken können (s. Abb. 2). Je schneller die Partikel diffundieren, desto schneller ändert sich auch die Intensität des Streulichts. Die Geschwindigkeit der Veränderung steht in direkter Beziehung zur Größe der Teilchen. Drei Faktoren bestimmen die Bewegung der Partikel:

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  • Die Temperatur: mit steigender Temperatur bewegen sich die Teilchen schneller.
  • Die Viskosität des Lösungsmittels: mit steigender Viskosität verlangsamt sich die Bewegung der Partikel.
  • Die Molekülgröße (Diffusionskoeffizient): je größer die Moleküle sind, desto langsamer bewegen sie sich.

Das bedeutet: sind Temperatur und Lösungsmittel bekannt und konstant, ist die Veränderung der Lichtstreuintensität unmittelbar vom Diffusionskoeffizienten und damit von der Molekülgröße abhängig. Daraus kann man den hydrodynamischen Radius (RH) ableiten.

Viel komplexer wird der Vorgang, wenn Teilchen von mehr als einer einheitlichen Größe vorhanden sind. Dann müssen mithilfe einer geeigneten Software die Größen der einzelnen Molekülspezies berechnet werden. Theoretisch lassen sich Molekülspezies mit einem Größenunterschied von 40 Prozent auseinander halten, praktisch liegt diese Grenze aber oft beim Faktor zwei bis drei. Vor der Messung ist so häufig eine Auftrennung der Probe, beispielsweise mittels Feldflussfraktionierung, sinnvoll, um sauber aufgelöste Daten zu erhalten.

Anwendungsbeispiele für die DLS

Die dynamische Lichstreuung besitzt zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten. Eine davon ist das Protein-Screening, das vor der Kristallisation von Eiweißen angewendet wird, um die optimalen Bedingungen für diesen Prozess zu untersuchen. So wird beispielsweise bestimmt, unter welchen Lösungsbedingungen sich Aggregate bilden. Die DLS-Software erlaubt die sichere Identifikation solcher Aggregate und eine Aussage darüber, ob die untersuchte Lösung mono- oder polydispers ist, also aus nur einer oder mehreren Proteinspezies besteht. Anhand der ermittelten Daten lässt sich das am besten geeignete Puffersystem für die Kristallisation festlegen.

Automatisierungsmöglichkeiten

Bei den meisten DLS-Anwendungen stellt die Geschwindigkeit, mit der die Küvette gereinigt und mit der nächsten Probe befüllt werden kann, den limitierenden Schritt hinsichtlich des Probendurchsatzes dar. Probleme, die den Durchsatz weiterhin reduzieren können, sind beispielsweise Staubpartikel oder Luftblasen in der Messküvette.

Um die Messung zu beschleunigen oder zumindest einen ganzen Satz von Proben parallel untersuchen zu können, bieten sich 96- oder 384-Loch-Platten an. Bisheriger Nachteil: man benötigte ein hohes Probenvolumen, und die Empfindlichkeit war – gegenüber der Verwendung von Quartzküvetten – um den Faktor 10 niedriger. Der Wyatt DynaPro Plate Reader (s. Abb. 3) hingegen ermöglicht sensitivere Messungen, die mit Küvettengeräten vergleichbar sind. Aufgrund seiner mechanischen Präzision ist sogar die Bestimmung von Proben in einer 1536-Lochplatte möglich, in der nur 5 µL Volumen je Probe benötigt werden. Abbildung 5 zeigt, wie sich im Wyatt DynaPro Plate Reader eine beliebige Probenanordnung in der Platte gestalten lässt. Der Anwender definiert selbst, wo die Proben lokalisiert sind, und in welchem spezifischen Messbereich jede Probe analysiert werden soll. Die individuellen Messdaten werden gespeichert und sind später für weitergehende Analytik abrufbar. Mithilfe von Labor-Robotern lässt sich diese Anwendung noch weiter automatisieren.

Sehr hohe Messpräzision wird auch beim Einsatz der DLS in Online-Systemen erreicht. Die Messdauer erweitert sich in Abhängigkeit von der Separationszeit auf einige Minuten. Dafür lassen sich die Radien der verschiedenen Fraktionen einer Probenmischung sehr genau bestimmen. Überdies kann analog mithilfe der Wyatt online-QELS (Quasi Elastic Light Scattering) nahezu jede polydisperse Probe analysiert werden.

Zusammenfassung

Die dynamische Lichtstreuung ist eine inzwischen weit verbreitete Technik zur Messung der Radien von gelösten Molekülen. Die Anwendungsbereiche der DSL-Technik umfassen einige der besonders schnell wachsenden Forschungsfelder: Proteine, Liposomen und Mizellen, Aggregatdetektion oder auch Größenbestimmung von Nanopartikeln. Auch das Monitoring beim Aggregationsverhalten von Proteinen in Abhängigkeit von Zeit und Temperatur ist eine verbreitete Applikation. Batch-Messungen bieten den Vorteil extrem hoher Empfindlichkeit, während automatisierte Verfahren einen großen Durchsatz an Proben ermöglichen.

*Dr. C. Ackerschott, M. Schneider, Wyatt Technology Europe, 56307 Dernbach

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