Effiziente Multimethode zur Analytik fettlöslicher Vitamine

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Automatisierte SPE macht den Unterschied

Eine Schlüsselstellung nahm hierbei die Festphasenextraktion (SPE) ein, der die Aufgabe zukommen sollte, verschleppte Fette aus dem Probenextrakt zu entfernen. Automatisiert wurden die SPE, wie auch alle weiteren Schritte der Probenvorbereitung und Probenaufgabe, auf dem Gerstel-Multi-Purpose-Sampler (MPS) in der Dual-Head-Variante. Dieser Samplertyp hat sich bereits in einer Vielzahl von Applikationen bestens bewährt. Der MPS bietet zudem verschiedene interessante Optionen, die in der vorliegenden Applikation benötigt wurden, unter anderem die Möglichkeit, divergente Lösemittel in unterschiedlichen Mengen zu dosieren, ohne Werkzeuge wechseln zu müssen, oder Probenextrakte bis zur Trockene einzudampfen und in einem HPLC-tauglichen Lösemittel wieder aufzunehmen.

Untersucht wurde der Gehalt an fettlöslichen Vitaminen in einem vitalisierenden Milchmischgetränk sowie in einem Nahrungsergänzungsmittel. Die Proben wurde homogenisiert, mit Essigester extrahiert und zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde für die anschließende Analyse verwendet.

Erfolgreicher Einsatz in der Praxis

Nach einer Reihe zielführender Experimente wurde folgende Vorgehensweise für die Bestimmung fettlöslicher Vitamine für gut befunden und in der Routineanalytik etabliert:

Der MPS konditioniert die SPE-Kartuschen unter Zugabe von Methanol und Essigester auf das C18-Sorbens. Anschließend werden zwei Milliliter Probenextrakt dosiert, um sicherzustellen, dass kein Methanol- oder Essigesterrest auf dem Sorbens zurückbleibt. Der resultierende Extrakt wird verworfen. Sodann werden weitere fünf Milliliter Probenextrakt dosiert. Die resultierende Lösung wird aufgefangen, in der Multi-Position-Evaporation-Station (^mVAP) des MPS bis zur Trockene eindedampft, der Rückstand wird in Acetonitril wieder aufgenommen und zur Analyse auf die Trennsäule gegeben. Für die Analyse verwendet wurde ein LC/MS-System bestehend aus einer Agilent 1290 HPLC mit 6495 Triple-Quadrupol-Massenspektrometer von Agilent Technologies (s. Abb. 2). Angelegt wurde ein Lösemittelgradient (A: 5 mM Ameisensäure, B: Methanol; Fluss: 0,5mL, 55 °C), bei der stationären Phase handelte es sich um ein C18-Reversed-Phase-Material. Detektiert wurde im positiven APCI-Modus.

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Nach etwas mehr als neun Minuten zeigte sich das erste Signal (D2) im Chromatogramm, das letzte nach etwas mehr als elf Minuten (K1) (s. Abb. 3). Alles in allem sind die Peaks hinreichend getrennt und gut auszuwerten. Gestoppt wurde der Lauf nach 17 Minuten. Damit war der Beweis erbracht, dass sich mit vorliegenden HPLC-MS/MS-Methode die drei oben genannten fettlöslichen Vitamine unter optimalen Bedingungen in einem Lauf in hoher Empfindlichkeit und sauber aufgetrennt nachweisen lassen.

Darüber hinaus ergaben Vergleichsmessungen einen signifikanten Unterschied zwischen der Analyse unter Einbindung der Festphasenextraktion (deutlich höhere Empfindlichkeit) und ohne. Zusätzlich brachte die Möglichkeit, Probenvorbereitung und Analysenlauf zeitlich zu verschachteln (Prepahead-Funktion), eine deutliche Beschleuniging der Messung: Die Aufbereitung und Bestimmung der ersten Probe dauerte 41 Minuten, jede weitere Probe benötigte nicht mehr als 24 Minuten bis zum Messergebnis.

Last but not least wurden auch die gemessenen Werte mit den Angaben der Deklaration verglichen. Im Milchmischgetränk wurde das Vitamin-E-Derivat Tocopherolacetat in einer Menge von 174 µg/g nachgewiesen, deklariert waren 200 µg/g. Beim Nahrungsergänzungsmittel wiederum wies die Deklaration 5,0 µg/g Vitamin K1 und 1,8 µg/g Vitamin D3 aus. Gemessen wurden 4,6 µg/g K1 und 1,5 µg/g D3. Das bedeutet, auch in puncto Wiederfindung erfüllt die hier vorgestellte HPLC-MS/MS-Methode höchste Ansprüche. Die Automatisierung führt zudem zu einer guten Wiederholbarkeit.

* F. Chmelka, M. Mathoviskaia und Dr. N. Helle: TeLA GmbH, 27624 Geestland

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