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Point-of-Care-Diagnose per Einzelmoleküldetektion Erregernachweis: Ohne PCR das richtige Antibiotikum wählen

Von Dr. Benedikt Hauer, Vivien Behrendt und Dr. Albrecht Brandenburg*

Bakterielle Infektionen können – gerade im Zeitalter von Antibiotikaresistenzen – gefährlich werden. Doch um das richtige Antibiotikum auszuwählen, muss man i. d. R. wissen, welcher Erreger vorliegt. Ein neues Point-of-Care-Diagnosesystem erlaubt nun den Erregernachweis auf Einzelmolekülebene.

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Abb. 1: Der Mikrofluidik-Chip wird in einer Schublade in das Testsystem eingebracht. Vor der optischen Auswertung sorgt eine miniaturisierte Fluidik im Inneren des Systems dafür, dass der Chip die notwendigen Reagenzien enthält.
Abb. 1: Der Mikrofluidik-Chip wird in einer Schublade in das Testsystem eingebracht. Vor der optischen Auswertung sorgt eine miniaturisierte Fluidik im Inneren des Systems dafür, dass der Chip die notwendigen Reagenzien enthält.
(Bild: © Fraunhofer IPM)

Bei der Behandlung von bakteriellen Infektionen entscheidet das richtige Antibiotikum über den Erfolg der Therapie. Besonders schwierig ist die Auswahl des geeigneten Medikaments, wenn die Erkrankung durch multiresistente Erreger ausgelöst wird, die unempfindlich gegenüber vielen Antibiotika sind. Denn die Suche nach dem wirksamsten Antibiotikum erfordert die Information über den Erreger-Typ, den man anhand genetischer Analysen des Erregers erhalten kann. Diese Aussagen sind in der Arztpraxis jedoch meist nicht sofort verfügbar, sondern erst nach einer Labordiagnose.

Um den Vorgang zu beschleunigen und zu vereinfachen, entwickelt das Fraunhofer IPM gemeinsam mit der LMU München im Projekt SiBoF eine neue Plattform für den Erregernachweis anhand einzelner Moleküle auf einem mikrofluidischen Chip. Der Fokus liegt auf einer einfach zu bedienenden Point-of-Care-Erkennung (POC). Das Vorhaben wird vom Bundesministerium für Bildung und Forschung BMBF gefördert.

DNA-Moleküle als Basis: Erreger spezifisch erkennen

Abb. 2: Das kompakte Gerät zum Nachweis multiresistenter Keime führt alle Reaktionsschritte automatisiert aus und liefert ein Ergebnis innerhalb einer Stunde. Schon wenige DNA-Moleküle reichen für den Nachweis.
Abb. 2: Das kompakte Gerät zum Nachweis multiresistenter Keime führt alle Reaktionsschritte automatisiert aus und liefert ein Ergebnis innerhalb einer Stunde. Schon wenige DNA-Moleküle reichen für den Nachweis.
(Bild: © Fraunhofer IPM)

Die portable, kompakte Test-Plattform verfügt über ein automatisiertes Fluidiksystem. Alle notwendigen Reagenzien werden in dem System vorgelagert. Der spritzgegossene Mikrofluidik-Chip wird zur Analyse per Schublade in das Testsystem eingebracht (s. Abb. 1). Bevor dann die optische Auswertung stattfindet, wird der Mikrofluidik-Chip mit den notwendigen Reagenzien versorgt. Um einen Teil des DNA-Strangs eines Erregers nachweisen zu können, genügt bei diesem neuen Verfahren bereits ein einzelnes DNA-Molekül, das an einer bestimmten Stelle am Chip anbindet. Auf dem Chip befinden sich Flui­dikkanäle, deren Oberflächen mit Bindungsstellen für spezifische Erreger präpariert wurden.

Miniaturisierter Pipettierroboter

Das Aufbringen der Reagenzien geschieht über eine fluidische Automatisierung mit einem miniaturisierten Pipettierroboter. In der Kartusche befinden sich Flüssigkeitsreservoirs mit der Probe und den Reagenzien sowie der Einlass in die Reaktionskammer. Mit dem Pipettierroboter werden die Medien entsprechend des Assay-Ablaufes in die Reaktionskammer eingegeben, die optisch ausgelesen wird. Sämtliche Reservoirs und der Einlass sind mit Septen verschlossen, sodass die Kartusche ein abgeschlossenes System darstellt.

Abb. 3: Aufbau des Mikrofluidik-Chips: Der Chip besteht aus einem Glas-Objektträger, der mit 
einem Polymerchip die Flusszelle bildet, die wiederum in einen Polymerträger eingebettet ist.
Abb. 3: Aufbau des Mikrofluidik-Chips: Der Chip besteht aus einem Glas-Objektträger, der mit 
einem Polymerchip die Flusszelle bildet, die wiederum in einen Polymerträger eingebettet ist.
(Bild: © Fraunhofer IPM)

Abbildung 3 zeigt die Details: Ein Polymerträger (gelb) beinhaltet sämtliche Zugänge für die Nadel inklusive der Septen. In dem Polymerträger befindet sich der Fluidik-Chip mit der Kammer für die optische Auslesung. Die chemische Vorbereitung des Fluidik-Chips kann entweder vollflächig im Bereich der optischen Auslesung erfolgen oder durch Spotting weiter strukturiert werden, wodurch die parallele Prüfung auf verschiedene Erreger möglich wird.

Nanoantennen verstärken Fluoreszenzsignale

Typischerweise werden Ziel-DNA- Moleküle in-vitro mithilfe spezifischer Fluoreszenzmarker nachgewiesen. Die Besonderheit der neuen Methode besteht darin, dass so genannte optische Antennen mit nanometergroßen Kügelchen die optischen Signale der Fluoreszenzmarker verstärken. Diese optische Verstärkung macht eine chemische Verstärkung über die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) überflüssig. Die Antennen bestehen aus nanometergroßen Metallpartikeln, die die Lichtintensität in einem winzigen Bereich durch einen Resonanzeffekt verstärken. Damit wird eine intensivere Anregung der Fluoreszenz erreicht, sodass auch das Fluoreszenzlicht deutlich verstärkt wird. Der molekulare Aufbau der gesamten Anordnung, mit der die Bindungsstellen und die Nanoantennen sehr präzise positioniert und auf der Chipoberfläche fixiert werden, stammen von unseren Projektpartnern der AG Tinnefeld, LMU München [1 – 4]. Die speziell konstruierte Struktur aus DNA-Molekülen, ein sogenanntes DNA-Origami (s. LP-Info-Kasten), hält die beiden Gold-Nanopartikel an Ort und Stelle.

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Ergänzendes zum Thema
LP-Info: DNA-Origami – was ist das?

DNA-Origami ist eine Methode zur Konstruktion von Objekten auf der Nanometerskala. Als Bausteine für diese Nanostrukturen dienen DNA-Einzelstränge, die miteinander verbunden werden um unterschiedlichste Objekte zu formen. Die absolute Größe der so konstruierten Objekte kann von wenigen bis hin zu hunderten von Nanometern reichen. Die Objekte haben dabei genau definierte Eigenschaften, die vom Nutzer bestimmt werden. Es ist möglich eine Vielzahl chemischer Modifikationen an praktisch jeder Stelle der Nanostruktur einzubauen. Die kann durch die Verwendung entsprechend modifizierter DNA-Oligonukleotide erreicht werden.

Quelle: www.eurofinsgenomics.eu

Zwischen diesen Nanopartikeln bietet die Struktur eine Bindungsstelle für das jeweilige Zielmolekül und einen Fluoreszenzmarker. Dieses patentierte Design bildet die Grundlage für die neuartige Assay-Technologie. Die jeweils 100 Nanometer großen Partikel dienen als Antenne.

Abb. 4: Reaktionsschema für den Fluoreszenz-Assay mithilfe von optischen Antennen. Die Antenne besteht aus einem DNA-Turm und zwei metallischen Nanopartikeln. Die Nachweisreaktion findet im Hotspot zwischen den Nanopartikeln statt, wo die Feldverstärkung am größten ist. Dort ist die Anbindestelle für die Erreger-DNA. Hat diese angebunden, kann ein Fluoreszenzfarbstoff ebenfalls anbinden und den erfolgreichen Nachweis markieren. Die Antennen verstärken das Signal um zwei Größenordnungen.
Abb. 4: Reaktionsschema für den Fluoreszenz-Assay mithilfe von optischen Antennen. Die Antenne besteht aus einem DNA-Turm und zwei metallischen Nanopartikeln. Die Nachweisreaktion findet im Hotspot zwischen den Nanopartikeln statt, wo die Feldverstärkung am größten ist. Dort ist die Anbindestelle für die Erreger-DNA. Hat diese angebunden, kann ein Fluoreszenzfarbstoff ebenfalls anbinden und den erfolgreichen Nachweis markieren. Die Antennen verstärken das Signal um zwei Größenordnungen.
(Bild: © LMU)

In dem Hotspot zwischen den beiden Goldpartikeln findet durch plasmonische Effekte eine Feldverstärkung statt. Platziert man dort einen Fluoreszenzfarbstoff, wird die detektierbare längerwellige Fluoreszenzstrahlung um ein Vielfaches verstärkt (s. Abb. 4). Auf diese Weise kann mit einer kleinen, kompakten optischen Vorrichtung ein einzelnes Molekül erkannt werden. Geringe Konzentrationen von Krankheitserregern lassen sich nachweisen.

Miniaturisiertes Mikroskop mit angepasster Beleuchtung

Das Herzstück des POC-Geräts ist ein vom Fraunhofer IPM entwickeltes miniaturisiertes hochauflösendes Fluoreszenzmikroskop, das aus preisgünstigen Einzelkomponenten besteht, damit es den Anforderungen eines Point-of-Care-Geräts gerecht werden kann. Die Optik-Einheit besteht aus einer Beleuchtung zur Anregung der Fluoreszenz sowie einem Mikroskop inklusive Kamera zur Abbildung. Mit spektral gefilterten LEDs erreicht man eine optische Leistungsdichte von 2 W/cm2 – genügend Licht, um damit einzelne Moleküle erkennen zu können.

Das Mikroskop besteht aus einem so genannten Tandemobjektiv – zwei entgegengesetzt angeordnete Standard-Kameraobjektive. Das Detektionsfilter befindet sich im parallelen Strahlengang. Eines der beiden Objektive verfügt über eine Flüssiglinse, mit deren Hilfe die Fokusebene elektronisch nachgeregelt werden kann. Eine spezielle Bildanalysesoftware identifiziert die Einzelmoleküle und ermöglicht so die Zählung der eingefangenen Zielmoleküle für ein quantitatives Ergebnis. Das System liegt als Demonstrator vor. Derzeit fehlt noch ein Modul zur Probenaufbereitung.

Schnelle Ergebnisse für viele Anwendungen

Das Ergebnis liegt schon nach einer Stunde vor und wird am Monitor angezeigt. Dies gilt nicht nur für multiresistente Keime, sondern auch für jede Art von DNA-Molekülen. Grundsätzlich lässt sich der Einzelmolekül-Assay nicht nur auf DNA-Moleküle anwenden, sondern auch auf RNA oder Antikörper. Die Funktionsweise des Verfahrens wurde durch zahlreiche Tests erfolgreich bestätigt.

Die Arbeiten wurden gefördert vom BMBF unter dem Förderkennzeichen 03VP03892 „SiBoF – Signal-Booster für Fluoreszenz-Assays in der Molekularen Diagnostik“.

Literatur:

[1] G. P. Acuna, F. M. Möller, P. Holzmeister, S. Beater, B. Lalkens und P. Tinnefeld, Sci­ence (New York, N.Y.) 2012, 338, 506–510, DOI: 10.1126/science.1228638.

[2] A. Puchkova, C. Vietz, E. Pibiri, B. Wünsch, M. Sanz Paz, G. P. Acuna und P. Tinnefeld, Nano letters 2015, 15, 8354–8359, DOI: 10.1021/acs.nanolett.5b04045.

[3] S. E. Ochmann, C. Vietz, K. Trofymchuk, G. P. Acuna, B. Lalkens und P. Tinnefeld, Analytical Chemistry 2017, 89, 13000–13007, DOI: 10.1021/acs.analchem.
7b04082.

[4] V. Glembockyte, L. Grabenhorst, K. Trofymchuk und P. Tinnefeld, Accounts of Chemical Research 2021, 54, 3338–3348, DOI: 10.1021/acs.accounts.
1c00307.

* Dr. B. Hauer, V. Behrendt und Dr. A. Brandenburg Fraunhofer-Institut für Physikalische Messtechnik IPM, 79110 Freiburg

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