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Drogenanalytik mittels DPX

Extraktionsverfahren für Opioidnachweis im Urin

| Autor/ Redakteur: Guido Deußing* / Christian Lüttmann

Wenn es um die Extraktion von Drogen- und Arzneimittelwirkstoffen geht, kommt meist die klassische Festphasenextraktion (SPE) zum Einsatz. Eine SPE-Variante verspricht eine höhere Effizienz und einen geringeren Lösungsmittelverbrauch. Lesen Sie, wie die so genannte Disposable Pipette Extraction (DPX) abläuft und welche Vorteile sie bietet.

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Abb.1: MPS-robotic pro mit DPX-Option und mVAP in Kombination mit einem HPLC-QQQ-MS-System, verwendet für die Bestimmung unterschiedlicher Opioide in Urin.
Abb.1: MPS-robotic pro mit DPX-Option und mVAP in Kombination mit einem HPLC-QQQ-MS-System, verwendet für die Bestimmung unterschiedlicher Opioide in Urin.
(Bild: Gerste)

Im Jahr 2017 starben laut US-amerikanischer Gesundheitsbehörde CDC (Centers for Disease Control and Prevention) in den USA 70 237 Menschen an einer Überdosis Drogen. In zwei Drittel der Fälle führte die missbräuchliche Einnahme von Opioiden den Tod herbei. Damit ist nicht zwangsläufig das bekannte Heroin gemeint. Maßgeblichen Anteil hatten Opioid-Analgetika, also Medikamente wie Fentanyl, Oxycodon und Tramadol, die zur Schmerztherapie eingesetzt werden, z.B. bei Krebserkrankungen. Solche Opioid-Analgetika werden häufig zusammen mit Heroin konsumiert [1].

Die in den USA ermittelten Opioid-bedingten Todesfälle stellen nur einen Bruchteil eines eklatanten Opioid-Missbrauchs dar. Die tatsächliche Zahl der Opioidabhängigen dürfte weitaus größer sein. Eine allzu leichtfertige Handhabung bei der ärztlichen Vergabe Opioid-haltiger Medikamente fördere diese Entwicklung, wie Medienberichte mutmaßen [2-4]. Mit einer umfangreichen Aufklärungskampagne versuchen die CDC auf die Gefahren des Opioid-Konsums hinzuweisen [5].

Die dispersive Extraktion

Auch aus forensisch-toxikologischer Sicht stellt der Missbrauch von Opioiden bzw. deren Nachweis eine Herausforderung dar – einerseits wegen der Vielzahl am Markt verfügbarer Präparate, andererseits aufgrund der Probenvorbereitung vor ihrer analytischen Bestimmung. Applikationsexperten des in Linthicum im US-Bundesstaat Maryland ansässigen Unternehmens Gerstel haben dafür eine vollständig automatisierte LC-MS/MS-basierte Analysenmethode entwickelt. Diese erlaubt es laut Foster et. al, unterschiedlichste Opioide schnell, effizient, sicher, sensitiv und komfortabel in Urin zu bestimmen [6].

Das Besondere der Methode sei die Art, wie die Analyten hydrolysiert und extrahiert werden: Statt der klassischen Festphasenextraktion (SPE) über gepackte Säulen wenden Foster et al. die Disposable Pipette Extraction (DPX) an. Bei der DPX handelt es sich um eine Variante zur SPE, bei der das Sorbens nicht gepackt vorliegt, sondern innerhalb einer Pipettenspitze frei beweglich ist. Dadurch werde beim Extraktionsvorgang, initiiert durch Ansaugen der Probenflüssigkeit in die Pipettenspitze, einerseits der Stoffaustausch mit der flüssigen Probe vielfach beschleunigt, andererseits sei auch das benötigte Probenvolumen deutlich geringer. Diese Aspekte, verbunden mit der Möglichkeit, die Analyse einschließlich Probenvorbereitung, Chromatographie und Detektion intelligent zu automatisieren, ließen Foster et al. die DPX als Verfahren der Wahl für die Opioid-Analyse von Urinproben erscheinen.

Erfolgreiche Automatisation

Es bedarf einer Vielzahl unterschiedlicher Probenvorbereitungsschritte, bevor sich durch die Analyse von Urin qualitative wie quantitative Rückschlüsse auf die konsumierten Opioide ziehen lassen. Am Anfang steht die enzymatische Hydrolyse der Analyten aus ihrer konjugierten Form (Glucuronide) in die molekulare Ausgangsform. Als Biokatalysator dient hier etwa ß-Glucuronidase. In genetisch modifizierter reiner Form kann dieses Enzym mehrere Drogenklassen innerhalb von 30 Minuten mit hoher Leistung sicher und reproduzierbar hydrolysieren. Die Voraussetzung dafür ist, dass pH-Wert, Temperatur und Einwirkdauer richtig eingestellt und gut aufeinander abgestimmt sind, wie Foster et al. berichten. Um schließlich noch die geforderten niedrigen Detektionsgrenzen für die jeweiligen Drogenverbindungen und ihre Metaboliten zu erreichen, sind störende Matrixbestandteile zu entfernen, etwa Salze, wie sie in Urin natürlicherweise vorhanden sind oder bei der Hydrolyse als Nebenprodukte anfallen können.

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Auch Serum-Analyse möglich

Gerstel hat nicht nur für die Opiodianalytik aus Urinproben ein Verfahren entworfen. Auch für die Bestimmung von Opioiden aus der Matrix Serum habe das Unternehmen in Zusammenarbeit mit dem Institut für Rechtsmedizin der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf eine vollständig automatisierte SPE-GC/MS-Methode entwickelt und in der Routineanalytik etabliert [7], berichtet Gerstel-Applikationsexperte Dr. Oliver Lerch.

Zur Vorbereitung und Aufgabe der Urinproben verwendeten Foster et al. einen Multi-Purpose-Sampler (Gerstel-MPS). Das System in der Ausführung „robotic pro“ war für die vollständig automatisierte Durchführung der DPX sowie weiterer Probenvorbereitungsschritte ausgestattet, u.a. mit einer Multi-Position-Evaporation-Station (Gerstel-mVap) zwecks Lösungsmittelwechsel und Eindampfen der Proben. Für die Analyse setzten Foster et al. ein online gekoppeltes HPLC-System (Agilent 1260), eine Poroshell-120-EC-C18-Säule (3,0 x 50 mm, 2,7 mm; Agilent Technologies) und ein Triplequadrupol-Massenspektrometer (QQQ-MS) mit Jet-Stream-Elektrospray-Quelle (Agilent Ultivo) ein. Die Methodenentwicklung erfolgte anhand realer Urinproben, die mit einer Masterlösung aus unterschiedlichen Opioiden dotiert waren. Bei den eingesetzten Wirkstoffen handelte es sich vornehmlich um Analgetika, die z.T. dem hiesigen Betäubungsmittelgesetz unterliegen, namentlich Buprenorphin, Codein, Fentanyl, Furanylfentanyl, Hydrocodon, Hydromorphon, Meperidin, Methadon, Morphin, Norbuprenorphin, Norfentanyl, Oxycodon, Oxymorphin, Sufentanil und Tramadol. Als interne Standards wurden deuterierte Analoga von Morphin, Norbuprenorphin, Tramadol, Buprenorphin, Meperidin, Fentanyl, Norfentanyl und Methadon verwendet, die als Lösung in einer Methanol-Wasser-Mischung (1:9) angesetzt waren.

Fokus auf die Durchführung

Das Besondere bei der Opioid-Bestimmung von Foster et. al ist die Probenvorbereitung, die unter Einsatz der DPX automatisiert auf einem gängigen Probenvorbereitungsrobotor (Gerstel-MPS) erfolgt. Gesteuert wird der MPS mittels Maestro-Software (Gerstel), die sich in diverse Chromatographie-Softwareprogramme integrieren lässt. Foster et. al analysierten Urinproben von jeweils 250 µL Volumen, die zunächst manuell in saubere 2-mL-Autosamplervials pipettiert und mit magnetischen Kappen für den späteren Transport im Autosampler verschlossen wurden. Die weitere Probenvorbereitungssequenz (Prep-Sequenz) verlief vollständig automatisiert in folgenden drei Schritten:

  • 1. Hydrolyse: Der MPS fügt der Urinprobe 135 µL der Master-Mischlösung zu. Anschließend wird das Vial zur mVAP-Station bewegt, wo die Probe 30 Minuten bei 55 °C inkubiert und bei 250 U/min durchmischt wird. Danach überführt der MPS 250 µL der hydrolysierten Urinprobe in ein sauberes, leeres Shell-Vial und fügt 100 µL einer zweiprozentigen Ameisensäure-Lösung in Wasser sowie 125 µL Acetonitril hinzu. Der MPS zieht die Probe in eine leere Pipettenspitze, durchmischt sie durch Ansaugen von Luft und gibt sie zurück ins Vial.
  • 2. DPX-Extraktion: Der MPS konditioniert eine DPX-CX-Spitze mit 500 µL einer dreißigprozentigen Acetonitril-Wasser-Lösung, saugt die gesamte hydrolysierte Urinprobe an und mischt Probe und Sorbens dispersiv durch Ansaugen von Luft. Die Probe wird 30 Sekunden equilibriert und in das Shell-Vial dispensiert. Die Extraktion der hydrolysierten Urinprobe wird wiederholt. Der MPS wäscht das DPX-CX-Sorbens zunächst mit 500 µL einer zehnprozentigen Acetonitril-Wasser-Lösung und dann mit der gleichen Menge reinen Acetonitrils. Die Analyten werden schließlich aus dem DPX-CX-Sorbens eluiert, mittels 750 µL einer Lösung aus Methylenchlorid, Isopropylalkohol und Ammoniumhydroxid (78:20:2). Das Eluat wird in einem sauberen 2-mL-Autosamplervial aufgefangen, die DPX-CX-Spitze wird in der Waste-Station entsorgt und 600 µL des Eluats werden in ein sauberes, leeres 2-mL-Autosamplervial transferiert, das mit einer magnetischen Kappe versehen ist.
  • 3. Eindampfen: Der MPS transportiert das Vial mit dem Eluat in die mVAP-Station, wo es bei 55 °C, 100 mbar und 250 U/min für die Dauer von zehn Minuten bis zur Trockene eingedampft wird. Die Aufnahme und Mischung des Rückstands erfolgt mit 250 µL einer 0,05-prozentigen ameisensauren Lösung, bestehend aus 5 mM Ammoniumformiat (A) und Methanol (B) in einem Mischungsverhältnis von 90:10. Anschließend transportiert der MPS das Vial zurück auf seine Ursprungsposition. Hiernach erfolgt die Injektion von 2 µL ins HPLC-System, das auf eine Flussrate von 0,5 mL/min eingestellt war und mit einem Eluentengradienten von A und B betrieben wurde. Die Säulentemperatur betrug 55 °C. Das QQQ-MS wurde im positiven Ionenmodus (ESI) betrieben.

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Blick auf das Ergebnis

Um die optimalen Hydrolyse-Bedingungen zu bestimmen, variierten Foster et al. die Inkubationszeit (0, 15, 30 und 60 Minuten). Sie verwendeten Urinproben, die mit jeweils 150 ng/mL Morphin-6ß-D-Glucuronid dotiert waren. Nach 15 Minuten Inkubation war die Konzentration des resultierenden Morphins maximal. Um sicherzustellen, dass alle Opioide vollständig und reproduzierbar hydrolysiert werden, wählten Foster et al. eine Inkubationszeit von 30 Minuten. Sie schreiben, dass damit die Quantifizierungsgrenzen für alle Analyten um den Faktor zwei niedriger liegen als verlangt. Die lineare Regressionsanalyse habe für alle mit dieser Methode analysierten Opioide R2-Werte von ≥0,99 ergeben. Die Richtigkeit der Messung betrug für alle Analyten im Durchschnitt 95,2%, die Präzision bzw. die relative Standardabweichung im Schnitt 3,91%.

Wie die LC-MS-Analyse beim Nachweis von Antibiotika in Hühnereiern hilft, lesen Sie in diesem Beitrag:

Die hier beschriebene Methode erweise sich nicht allein in Bezug auf US-amerikanische Verhältnisse als beachtlich effizient, sondern auch mit Blick auf die Entwicklungen hierzulande, sagt Gerstel-Applikationsexperte Dr. Oliver Lerch vom Stammsitz des Unternehmens in Mülheim an der Ruhr: „Zwei Drittel der tödlich verlaufenen Drogenmissbrauchsfälle in Deutschland lassen sich laut ‚Drogen- und Suchtbericht 2018‘ auf die Einnahme opioidhaltiger Substanzen zurückführen.“ Zugleich hätten demnach auch polyvalente Vergiftungen unter Beteiligung von Opioiden zugenommen [1], was den Einsatz leistungsstarker Analysenmethoden in der forensischen Toxikologie rechtfertige.

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