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Automatisierte Dosierung von flüchtigen und umweltschädlichen Lösungsmitteln

Eine ähnliche Situation tritt auf, wenn Proben für die NMR-Analyse von Speiseölen vorbereitet werden sollen. Hier wird die Matrix in deuteriertem Chloroform (CDCl₃) gelöst, was bei der Handhabung in großen Mengen sowohl einen Kostenfaktor als auch eine Gefahr für Gesundheit von Personal und eine Belastung für die Umwelt darstellt. Die manuelle volumetrische Handhabung kleiner Mengen ist jedoch eine Herausforderung und wiederum mit erheblichem Zeitaufwand verbunden, wenn hohe Präzision und hohe Reproduzierbarkeit erreicht werden sollen.

Bei der gravimetrischen Probenpräparation erfolgt – ähnlich wie bei Honig – eine grobe Dosierung der Ölmenge, gefolgt von einer präzisen Bestimmung der Einwaage. Die anschließend automatisch berechnete Menge CDCl₃ kann präzise dosiert werden, wobei das Gesamtvolumen an deuteriertem Lösungsmittel deutlich unter 1 ml pro Probe gehalten werden kann. Auch hier wird die Probenvorbereitung im Vergleich zum manuellen Wiegen und Pipettieren nicht nur wirtschaftlicher und nachhaltiger, sondern auch schneller und reproduzierbarer.

Automatisierte Vorbereitung von Aufstockungsproben für Kalibrierungsmessungen

Die automatisierte gravimetrische Dosierung bietet auch in vielen anderen Fällen Vorteile. Ein solches Szenario stellen beispielsweise Aufstockungsexperimente (Spiking-Experimente) zur Quantifizierung von mutmaßlichen Markersubstanzen in wässrigen Extrakten von Getreideproben mittels NMR-Spektroskopie dar. Was auf den ersten Blick trivial erscheint, entwickelt sich zu einem anspruchsvollen Verfahren, wenn es darum geht, die Unsicherheit bei der Probenvorbereitung auf 1% pro Schritt zu begrenzen.

Zunächst wurde festgestellt, dass wässrige Extrakte von Getreidekörnern einen sinnvollen Kompromiss für NMR-Studien darstellen, welche auf die gleichzeitige Prüfung traditioneller Qualitätsparameter (z.B.: Rohprotein, Asche, Feuchtigkeit, Kleber, Fallzahl) und der Authentizität (einschließlich der botanischen und geographischen Herkunft) der untersuchten Getreide abzielen. Für die Extrakte wurde zunächst durch Mahlen einer repräsentativen Getreideprobe ein Vollkornmehl mit einer definierten Partikelgröße hergestellt. Wichtig in diesem Zusammenhang ist ein Mahlprozess, der die Probenzusammensetzung nicht durch zu viel Wärmezufuhr verändert und damit Prüfparameter wie die Feuchtigkeit beeinflusst. Für kleine Mengen erwies sich das Mahlen mit einer Kugelmühle als am geeignetsten, während größere Probenpartien mit einer Prallmühle vorgemahlen werden mussten. Als nächstes wurde eine definierte Menge Mehl mit Wasser im Verhältnis 1:40 (w/v) extrahiert. Dieses hohe Verdünnungsverhältnis ist aufgrund der Eigenschaften von Mehl notwendig, die sonst zu sehr viskosen Lösungen führen, was sich wiederum nachteilig auf das NMR-Spektrum (Linienverbreiterung und ungleichmäßige Basislinien) auswirkt.

Reproduzierbarkeit bei Extraktionen

Um reproduzierbare Extrakte zu erhalten, ist es besonders wichtig, Temperatur, Dauer und Art der Bewegung (Überkopfmischung) während des Extraktionsvorganges sowie die Bedingungen für die Zentrifugation nach der Extraktion zu standardisieren. Für Routine-NMR-Messungen eines groß angelegten Screening Projektes von über 1.700 Getreideproben, wurde ein Protokoll entwickelt, bei dem 50 mg (± 0,3 mg) auf einer Waage mit einer Auflösung von mindestens 0,1 mg (z.B. XA205DR eingestellt auf 0,1 mg Anzeigeauflösung) eingewogen werden und anschließend 2 ml reines Wasser als Extraktionsmittel hinzugefügt wurden. Für diesen Zweck wurden automatische Rainin E4XLS-Pipetten verwendet, was die Reproduzierbarkeit bei verschiedenen Anwendern im Vergleich zu manuellen Pipettiervorgängen deutlich verbesserte.

Dieser Ansatz reicht jedoch nicht aus, wenn Aufstockungsexperimente mit dem Ziel durchgeführt werden, Signale von Verbindungen in der jeweiligen Matrix zu identifizieren und Kalibrierkurven für die Quantifizierung von einzelnen Substanzen zu erstellen. Die Aufstockung wurde durch Zugabe fester, reiner Reagenzien zum gemahlenen Vollkornmehl durchgeführt, die anschließend dem oben beschriebenen Extraktionsvorgang unterzogen wurden. Um Mengen von nur 0,5% (entsprechend 5 mg Referenzverbindung pro Gramm Probe) mit einer Genauigkeit von 1% der Mehlmenge zugeben zu können, muss eine hochpräzise Waage verwendet werden. Ein unterer Grenzwert von 0,5% (w/w) ist dabei erforderlich, wenn man bedenkt, dass in Mehlextrakten eine große Anzahl von minoren Bestandteilen enthalten ist, der Großteil des Gewichtsanteils aber nur von wenigen Substanzen stammt.

Nebenbestandteile erfordern besondere Präzision

Es hat sich jedoch bereits bei anderen Lebensmitteln wie Honig gezeigt, dass die Quantifizierung von Nebenbestandteilen einen wichtigen Beitrag zur Echtheitsprüfung leistet. So ist beispielsweise bei einer Zielmenge von 5 mg der hinzuzufügenden Referenzsubstanz eine Anzeigeauflösung von mindestens fünf Stellen (10 μg) erforderlich, um die gewünschte Genauigkeit und Präzision zu erreichen. Gleichzeitig erfordert dies auch, dass die Gesamtmenge des Mehls auf 995 mg erhöht wird, um den Zielwert von 0,5% (w/w) der zugesetzten Referenzsubstanz zu erreichen. Dies wiederum erhöht die Menge des hinzuzufügenden Lösungsmittels: Bei einem Verhältnis von 1:40 (w/v) müssen jetzt 40 ml zugegeben werden, was eine Herausforderung für die Waage in Bezug auf Empfindlichkeit und Dynamikbereich darstellt. Unter Verwendung einer XPE206DR, die Wägungen in Mengen von nur 3 mg (mit einer Präzision von 1%) bei einer maximalen Gesamtlast von 81 g (niedrigerer Arbeitsbereich mit höherer Genauigkeit) ermöglicht, wurde die kleinstmögliche relative Menge der hinzugefügten Referenzsubstanz mit nur 0,2% (w/w) berechnet.⁽⁴⁾

Die hier festgelegten Präzisionsanforderungen sind wichtig für Technologien wie die NMR-Spektroskopie. Zum Erreichen der hohen Reproduzierbarkeit dieser Methode erfordert die Probenvorbereitung hohe Präzision. Der lineare dynamische Bereich von mehr als fünf Größenordnungen ermöglicht es dann, Substanzen im mg/kg-Bereich vor einem Hintergrund von Substanzen nachzuweisen, die in Konzentrationen von Hunderten von g/kg vorhanden sind. Im Fall von Honey-Profiling beträgt die Quantifizierungsgrenze für 5-Hydroxmethylfurfural 5 mg/kg, während die Hauptzucker Glucose und Fructose bei Konzentrationen von mehr als 300 g/kg in derselben Messung quantifiziert werden. Das hier beschriebene Verfahren ist sehr genau, erfordert jedoch das zeitaufwändige Einwiegen in akkuraten Mengen oder – unter der Annahme, dass die kleinere Menge nur grob eingewogen wird – die Berechnung der Mehlmenge, die eingewogen werden muss, um das gewünschte Konzentrationsverhältnis zu erreichen. Letzteres ist ebenfalls zeitaufwändig und zudem bei einem hohen Durchsatz an Proben anfällig für Rechenfehler durch den Anwender.

(4) 3 mg Referenzsubstanz plus 1,522 g Mehl ergeben insgesamt 1,525 g trockene Masse, die nun 61 ml Wasser (Dichte 0,9977 @ 22 °C) für die Extraktion erfordern, woraus sich eine Gesamtmasse von ca. 62,4 g ergibt. In Verbindung mit dem Probengefäß (etwa 15 g für ein 50 ml Probenröhrchen mit konischem Boden) wird damit der untere Wägebereich der XPE206DR (Maximallast von 81 g) vollständig ausgenutzt. Eine Nutzung des größeren Wägebereiches (Maximallast 220 g bei d=0,00001 g) führt aufgrund des größeren Taragewichtes der für die größeren Volumina erforderlichen Gefäße in unserer Erfahrung in der Regel zu keiner weiteren Verbesserung.

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