Leistungsstarke Kombination von Real-Time- und digitaler PCR

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Wenn qPCR und dPCR aufeinandertreffen

Einige Anwendungen lassen sich durch den Einsatz beider Technologien verbessern. So benötigt die qPCR Standardkurven zur absoluten Quantifizierung mittels Referenzmaterial bekannter Menge. Die Herstellung solcher Referenzstandards ist arbeitsaufwändig und sollten sich die Standards mit der Zeit verändern, werden die qPCR-Ergebnisse verfälscht. Da die digitale PCR keine Standardkurven benötigt, stellt sie eine ideale Ergänzung zur Herstellung und absoluten Quantifizierung solcher qPCR-Standards dar. Mit ihrer hohen Präzision und Reproduzierbarkeit bietet sie zudem eine optimale Intra- und Interlaboratoriums-Reproduzierbarkeit.

Ein weiteres Beispiel dafür wie sich beide Methoden ergänzen wurde von Jiang et al [1] für die Analyse der miRNA-Expression bei der Stammzellendifferenzierung beschrieben. Während die qPCR aufgrund ihres großen dynamischen Detektionsbereiches zur Bestimmung großer Änderungen der Genexpression (bis 25-fach) eingesetzt wurde, ließen sich mit der ddPCR kleinere Variationen (3- bis 4-fach) unter dem Einfluss epigenetisch wirksamer Faktoren extrem genau bestimmen.

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Die Analysen- und Diagnostikfirma Biogazelle (Belgien) verwendet qPCR und dPCR als komplementäre Technologien, um Fragestellungen aus verschiedenen Perspektiven zu betrachten. Zwar erachtet man qPCR wegen des Durchsatzes und Kostenfaktors immer noch als „Goldstandard“ für die Genexpressionsanalyse; aufgrund des Interesses an zirkulierender RNA und DNA, Krebsmutationen, Kopienvariationen und Detektion seltener Ereignisse findet hier seit einigen Jahren aber auch das QX100-ddPCR-System von Bio-Rad Verwendung.

Von der Theorie in die Praxis

So konnte Biogazelle die ddPCR nutzen, um ein anderes Biotechnologieunternehmen beim Entwurf eines PCR-basierten Tests für transgene Kopienvariationen zu unterstützen. Die Vorversuche mit qPCR ermöglichten lediglich eine grobe, in der Praxis wenig brauchbare, Erfassung von Änderungen über 50 %. Mittels ddPCR konnte man erstmals auch geringere Varianzen der Kopienzahlen bestimmen, die nun zur präziseren und zuverlässigeren Erfassung eines fortschreitenden Verlustes an transgenen Kopien Verwendung finden. In einem anderen Fall wurde die ddPCR für die im Vergleich zur qPCR präzisere und genauere Quantifizierung zirkulierender RNA im Plasma von Krebspatienten verwendet. Bei Biogazelle findet also sowohl die qPCR als auch die dPCR Verwendung. Die Mitarbeiter entwickeln zunehmendes Wissen und Verständnis dafür, welche experimentellen Anforderungen beide Methoden adressieren und welche Kombinationen aus beiden Technologien benötigt werden. Ähnlich leisten auch Wissenschaftler weltweit Pionierarbeit zur synergetischen Nutzung beider Technologien. So wurde die Präzision der digitalen PCR genutzt, um optimierte qPCR-Protokolle zu entwickeln. Im Umkehrschluss verwenden viele Gruppen die qPCR zur Validierung von dPCR-Daten.

Zukunft der Genomforschung

Dank der Weiterentwicklungen hinsichtlich Geschwindigkeit und Effizienz ist die qPCR für größere Studien insbesondere zur Erreichung des notwendigen Probendurchsatzes unabdingbar. Aktuelle Plattformen sind mit 384-Well-Platten kompatibel und können recht einfach mit automatisierten Pipetierrobotern zur kontinuierlichen Erfassung von qPCR-Daten ausgebaut werden. Somit lässt sich die qPCR überall da einsetzen, wo viele Proben mit geringem Arbeitsaufwand untersucht werden müssen. So kann die Laborkapazität auf tausende Analysen pro Tag skaliert werden, um z.B. Populationstrends oder spezifische Sequenzen in vielen verschieden Proben zu identifizieren. Mit den Multiplex-Optionen vieler qPCR-Systeme, welche die Quantifizierung von vier oder mehr Zielsequenzen erlauben, kann der Durchsatz weiter erhöht werden. Gleichzeitig lässt sich die Gesamtzahl der Reaktionen und so deren Kosten reduzieren.

Die Fähigkeit schnell und sensitiv eine begrenzte jedoch relevante Anzahl von Genen einer größeren Population zu untersuchen, unterstreicht auch die Komplementarität der qPCR und dPCR mit den Methoden zur Identifizierung von Gentargets mittels Next Generation Sequencing.

Ein Blick in den Bereich der Liquid Biopsy verdeutlicht, wie sehr neue Technologien wie die dPCR die wissenschaftliche Forschung vorantreiben können. Den konventionellen Methoden zur Erfassung seltener Ereignisse mangelt es an Selektivität und entsprechend versagen diese bei der Detektion von mutierten Sequenzen vor einem hohen Hintergrund an Wildtyp-Sequenzen. Die höhere Selektivität der dPCR ermöglicht auch die Detektion somatischer Mutationen mit hoher Sensitivität, was grundsätzlich eine frühere, minimalinvasive Diagnose ermöglicht.

Aufgrund ihrer unterschiedlichen Funktionsweise erweitert die Kombination beider PCR-Technologien unsere Detektionsmöglichkeiten. Im Gegensatz zur relativen Messung durch die qPCR ermöglicht die dPCR eine absolute Messung von Nukleinsäuren. Diese absolute DNA-Quantifizierung bietet jene Präzision, Reproduzierbarkeit und Sensitivität welche benötigt wird, um geringe Varianzen vor dem Hintergrund an Wildtyp-Sequenzen akkurat bestimmen zu können. Dagegen stellt die qPCR eine gut etablierte Methode dar, welche sich durch Geschwindigkeit, Durchsatz und Flexibilität auszeichnet. Sie eignet sich hervorragend für Genexpressionsstudien (sofern eine absolute Quantifizierung weniger im Vordergrund steht), bei Hochdurchsatzstudien und als „Goldstandard“ zur Validierung anderer Methoden.

Literatur:

[1] Jiang, K., Ren, C., & Nair, V. (2013). MicroRNA-137 represses Klf4 and Tbx3 during differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Research, 11(3) 1299-1313

* C. Reifsnyder: Bio-Rad Digital Biology Center, Pleasanton/USA

* *Y. Jouvenot: Bio-Rad, Hercules/USA

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