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PCR hoch zwei Leistungsstarke Kombination von Real-Time- und digitaler PCR

| Autor / Redakteur: Carolyn Reifsnyder* und Yann Jouvenot** / Dr. Ilka Ottleben

1983 von Kary Mullis entwickelt, ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) heute aus keinem molekularbiologischen Labor wegzudenken. Durch die intelligente Kombination von qPCR und dPCR lässt sich ihre Leistungsfähigkeit für bestimmte Anwendungen gezielt steigern.

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Abb. 1: Die PCR vervielfältigt auch kleinste Mengen DNA durch wiederholte Verdopplung in mehreren Zyklen mithilfe des Enzyms DNA-Polymerase.
Abb. 1: Die PCR vervielfältigt auch kleinste Mengen DNA durch wiederholte Verdopplung in mehreren Zyklen mithilfe des Enzyms DNA-Polymerase.
(Bild: © science photo - Fotolia)

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) hat sich als fundamentale Methode zur Messung von Nukleinsäuren etabliert. Zur Quantifizierung werden dabei zwei Verfahren verwendet: die quantitative Real-Time-PCR (qPCR) und die digitale PCR (dPCR).

Während die qPCR als nahezu universelle Methode zur Genanalyse zum Einsatz kommt, ermöglicht die dPCR solche Anwendungen, bei denen eine absolute Quantifizierung mit höherer Präzision und Reproduzierbarkeit erforderlich ist. Beide Techniken haben zwar ihren speziellen Nutzen; immer mehr Wissenschaftler erkennen aber, dass die Kombination beider Techniken auch die Beantwortung komplexerer Fragestellungen ermöglicht.

Die quantitative Real-Time-PCR

Die quantitative Real-Time-PCR ist aufgrund ihres großen dynamischen Bereiches, dem hohen Probendurchsatz im industriellen Maßstab sowie der geringen Kosten pro Probe weiter verbreitet. Die digitale PCR hat aber die bisherigen Einschränkungen der Quantifizierung von Nukleinsäuren überwunden und findet daher zunehmend Verwendung in den Bereichen Krebsmutationen, Liquid Biopsy, Kopienzahl Variation und Detektion seltener Ereignisse. Für den Genomforscher stellt sich also nicht mehr die Frage „welche PCR-Technologie sollte ich verwenden“, sondern vielmehr „wie kann ich die Stärken beider Technologien optimal miteinander kombinieren“?

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Auch wenn die dPCR vermehrt zum Einsatz kommt, bleibt die qPCR das Arbeitstier in der molekularbiologischen Forschung. Sie hat sich als leistungsfähige und zuverlässige Technologie etabliert, auf die Forscher wegen ihrer Geschwindigkeit, Sensitivität und Einfachheit vertrauen. Da mit dieser Methode die absolute oder relative Menge eines Gentargets im Vergleich mit einer Standardkurve oder relativ zu einem Kontrollgen bestimmt werden kann, eignet sie sich besonders für Genexpressionsanalysen bei denen verschiedene experimentelle Bedingungen, wie beispielsweise krankes und gesundes Gewebe, miteinander verglichen werden. Da die qPCR bereits seit den 90er Jahren verwendet wird, können Forscher für ihre experimentelle Gestaltung auf eine Vielzahl von Technologieoptionen und Publikationen zurückgreifen. Mit einem optimierten qPCR-Ansatz kann man dabei von einigen wenigen bis zu millionenfachen Kopien einer Zielsequenz pro Reaktion bestimmen, was den beachtlichen dynamischen Bereich dieser Methode verdeutlicht. Mit der Möglichkeit, sehr geringe und hohe Kopienzahlen in einem Experiment zu erfassen, eignet sich dieqPCR besonders für Screening- oder Validierungsexperimente. Die Wahl der geeigneten Nachweisreagenzien in der qPCR ermöglicht dem Forscher zusätzliche Kontrolle und Flexibilität beim Assaydesign. Er kann zwischen kostengünstigen interkalierenden Farbstoffen wie SYBR Green oder Evagreen sowie einer Vielzahl an Gen-spezifischen Sonden (z.B. Hydrolysesonden oder Molecular Beacons) wählen. Die Kosten pro Probe sind sehr flexibel, da der Anwender das Reaktionsvolumen, den Durchsatz und die Nachweismethode je nach experimentellen Bedürfnissen variieren kann.

Die digitale PCR

Die digitale PCR ist eine Methode zum Auszählen einzelner Nukleinsäuremoleküle. Dabei wird die Probe auf tausende Einzelreaktionen (Partitionen) verteilt, sodass jede Einzelreaktion nur eine sehr geringe Anzahl an DNA- oder RNA-Molekülen des gesuchten Gentargets enthält. Im Falle der Droplet Digital PCR (ddPCR) (s. Abb. 2) erfolgt die Verteilung der Probe in sehr viele einzelne Tröpfchen (droplets) durch die Verwendung von Mikrofluidics. Die Aufteilung der Probe in räumlich getrennte Kompartimente minimiert die Konkurrenz von RNA- oder DNA-Molekülen miteinander. Dadurch hat sich dieses Prinzip als besonders nützlich erwiesen für die Untersuchung von Krebsmutationen (Diagnose, Therapiekontrolle, frühe Rückfallerkennung), somatischen Mosaiken, die Quantifizierung der viralen Belastung bei chronischen Infektionen, der Pränataldiagnostik genetischer Krankheiten bis hin zum Nachweis von GMO in Nahrungsmitteln. Bei der digitalen PCR wird im Gegensatz zur Real-Time-PCR die Ausgangszahl der Moleküle in einer Probe durch das Auszählen von positiven und negativen Reaktionen am Ende der Amplifizierung bestimmt. Durch die Partitionierung der Probe und die Verwendung einer Endpunkt-PCR wird die Quantifizierung wesentlich weniger von biologischen oder durch die Probenvorbereitung eingebrachten Inhibitoren beeinflusst. Aufgrund der höheren Inhibitortoleranz eignet sich diese Technologie besonders für solche Anwendungen, bei denen eine Probenvorbereitung generell vermieden werden sollte. Dazu zählen z.B. die Quantifizierung verbleibender Wirtszellen-DNA in der Organ- und Blutspende oder der Einsatz von Proben mit komplexem Hintergrund im Bereich der Liquid Biopsy.

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