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Next Generation Sequencing

Metagenomstudien mit Next Generation Sequencing

| Autor/ Redakteur: Katie Montgomery und Thomas Jarvie* /

Bis vor kurzem war die Metagenomforschung limitiert durch hohe Kosten, niedrigen Durchsatz und die bei der Sanger-Methode auftretende Ergebnisungenauigkeit durch Klonierungsschritte. Mit Next Generation Sequencing lässt sich nun ein umfassendes Bild von Metagenom-Proben gewinnen.

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Die Metagenomforschung untersucht komplexe Gemeinschaften von Organismen wie sie sich z.B. in einer Meeresschicht finden. Next Generation Sequencing bietet völlig neue Möglichkeiten für umfassende Analysen.
Die Metagenomforschung untersucht komplexe Gemeinschaften von Organismen wie sie sich z.B. in einer Meeresschicht finden. Next Generation Sequencing bietet völlig neue Möglichkeiten für umfassende Analysen.
( Bild: Roche )

Die Metagenomforschung (metagenomics) untersucht die gesamte genetische Information einer komplexen Mischung von Mikroorganismen in einem bestimmten Lebensraum. Die Hauptziele solcher Untersuchungen sind die Charakterisierung der in einer Probe vorhandenen Organismen und die Identifizierung der Rolle, die sie in diesem Lebensraum spielen. Metagenom-Proben lassen sich fast überall finden, z.B. in verschiedenen Bereichen des menschlichen Körpers, in Bodenproben, in extremen Lebensräumen wie der Antarktis, Untertagebergwerken, heißen Quellen oder verschiedenen Meeresschichten.

Bis vor kurzem waren die Analysemethoden aufgrund technischer und wirtschaftlicher Beschränkungen nicht geeignet, um ein repräsentatives Bild mikrobieller und viraler Lebensgemeinschaften, ihrer Stoffwechselprofile und ihrer Anpassungsmuster zu liefern. Fortschritte auf dem Gebiet der Sequenzierungstechnologie, u.a. durch die Einführung des Pyrosequencings mit dem Genome Sequencer FLX-System, das hochgradig parallele Readouts ermöglicht, haben zu einer Explosion der Zahl von Metagenom-Forschungsvorhaben geführt. Enorme Verbesserungen des Durchsatzes und der Verzicht auf Klonierungsschritte, die das Ergebnis verzerren können, haben die Applikationsbreite weit über die herkömmliche Analyse von 16S-rRNA-Genen wachsen lassen. Aktuelle Veröffentlichungen auf Grundlage von Genome Sequencer FLX-Daten, die sich beispielsweise mit der Erforschung mikrobieller Vielfalt, der Genausstattung von Organismen, dem Metatranskriptom oder dem Nachweis viraler Krankheitserreger beschäftigen, verdeutlichen die Breite dieses wachsenden Forschungsfeldes. Das Genome Sequencer FLX -System ist perfekt geeignet für Metagenomstudien, da seine langen Leseweiten für die hohe Spezifität sorgen, die für einen Vergleich der Sequenzierungsergebnisse mit DNA- oder Proteindatenbanken und für eine eindeutige Artenbestimmung und Genidentifizierung notwendig ist.

Mikrobielle Vielfalt in der Umwelt und Genausstattung von Organismen

Metagenom-Untersuchungen werden aus unterschiedlichen Gründen durchgeführt. Beispiele sind die Momentaufnahme der in einem Lebensraum vorhandenen Organismen, die Charakterisierung der Rolle, die der Stoffwechsel der Mikroorganismen in einem Lebensraum spielt, oder die Erforschung der Reaktion einer mikrobiellen Lebensgemeinschaft auf Lebensraumveränderungen.

Kürzlich wurde in einer Studie die Vielfalt und Funktion einzelliger stickstofffixierender Cyanobakterien (UCYN), die weit verbreitet im Meer vorkommen, untersucht [1]. Frühere Arbeiten hatten Hinweise auf die Existenz einer eigenen phylogenetischen Gruppe erbracht, die ihre Nitrogenase-Gene (UCYN-A) vor allem tagsüber exprimiert statt abends. Dieses Verhalten war für Cyanobakterien bisher noch nie beschrieben worden, aber da diese Art nicht kultiviert werden konnte, war ihre weitere Erforschung mit traditionellen Mitteln nur stark eingeschränkt möglich. Nach einer Durchflusszytometrie-Sortierung der Mikroorganismen einer Meerwasserprobe anhand ihrer 16S rRNA wurde mittels schneller Shotgun-Sequenzierung mit dem GS FLX Titanium-System (Leseweite 400 bp) eine Genombibliothek mit 10-facher Abdeckung des 2 bis 3 Mb großen UCYN-A-Genoms hergestellt. Nach Zusammensetzen der Reads mithilfe einer BLAST-Analyse befand sich der gesamte Nitrogenase-Gencluster auf einem Contig. Sequenzen von Genen, die für das sauerstoffproduzierende Photosystem II oder für die Kohlenstofffixierung zuständig sind, fehlten. Dieses überraschende Ergebnis, durch einen einzigen Sequenzierlauf erhalten, stellt den ersten Bericht über frei lebende Cyanobakterien dar, die nicht phototroph leben.

  • Im zweiten Teil erfahren Sie mehr über Analysen der mikrobiellen Vielfalt im Menschen
  • Im dritten Teil erfahren Sie mehr über die Metatranskriptomforschung

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