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CHROMATOGRAPHIE Methodenumstellung von HPLC auf UPLC

Autor / Redakteur: FALK-THILO FERSE*, DIRK SIEVERS**, MICHAEL SWARTZ*** / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Durch Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) wird bei chromatographischen Trennungen eine außerordentliche Auflösung, Empfindlichkeit und Geschwindigkeit erzielt.

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Die Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) nutzt die Vorteile, die sich aus der Verwendung kleiner Partikel (1,7 µm) unter erhöhtem Arbeitsdruck ergeben, um bei chromatographischen Trennungen eine außerordentliche Auflösung, Empfindlichkeit und Geschwindigkeit (1-5) zu erzielen. Zur Ausschöpfung der Vorzüge dieser neuen Technologie ist es notwendig, bestehende Methoden der High Performance Liquid Chromatography (HPLC) auf die UPLC umzustellen.Auf den ersten Blick scheint die Umstellung bestehender HPLC-Methoden auf die UPLC eine echte Herausforderung zu sein. Tatsächlich aber ist die Aufgabe der Methodenumstellung äußerst einfach und überschaubar, sofern man die Chemie und die Dimensionen der Säule passend wählt und eine korrekte Skalierung des Injektionsvolumens, der Flussrate und der Gradientenbedingungen (sofern zutreffend) vornimmt.Auswahl der richtigen SäuleEine mit 1,7-µm-Partikeln gepackte Säule bietet aufgrund ihrer besseren Effizienz eine signifikant höhere Auflösung. Die Trennung von Probenkomponenten erfordert jedoch weiterhin eine gebundene Phase, die für Retention und Selektivität sorgt. Für UPLC-Trennungen sind vier gebundene Phasen verfügbar: Acquity UPLC BEH C18 und C8 (Säulen mit unverzweigten Alkylketten), Acquity UPLC BEH Shield RP18 (Säulen mit eingebetteter polarer Gruppe) und Acquity UPLC BEH Phenyl (Phenylgruppe, gebunden an die Silyl-Funktion mit einer C6 Alkylkette). Jede Säulenchemie bietet eine andere Kombination aus Hydrolysestabilität, Hydrophobie, Silanolaktivität und chemischer Interaktion mit den Analyten (s. Abb.1).Acquity UPLC BEH C18 und C8 Säulen wurden als universelle Säulen für die meisten UPLC-Trennungen konzipiert, da sie den breitesten pH-Bereich abdecken. Acquity UPLC BEH C18 und C8 Säulen nutzen eine trifunktionelle Ligandenbindung, die für eine überlegene Stabilität im niedrigen pH-Bereich sorgt. Um einen möglichst breiten pH-Bereich abzudecken, ist diese Stabilität gegenüber niedrigen pH-Werten kombiniert mit der hohen Robustheit der 1,7-µm BEH Partikel gegenüber hohen pH-Werten. Acquity UPLC BEH Shield RP18 Säulen sollen zu den Acquity UPLC BEH C18 und C8 Phasen eine komplementäre Selektivität bereitstellen. In den Acquity UPLC BEH Shield RP18 Säulen wird die patentierte Shield-Technologie mit der BEH-Technologie kombiniert.Dies geschieht durch Einbeziehung einer eingebetteten Carbamat-Gruppe in den Liganden der gebundenen Phase und führt zu alternativen Selektivitätseigenschaften und einer exzellenten Peakschärfe. Acquity UPLC BEH Phenyl Säulen nutzen eine trifunktionelle C6 Alkylbindung zwischen Phenylring und Silylfunktion. Dieser Ligand bietet in Kombination mit den gleichen Endcapping-Prozeduren, die bei Acquity UPLC BEH C18 und C8 Säulen zur Anwendung kommen, eine lange Säulenlebensdauer und eine hohe Peakschärfe. Die Kombination von Ligand und Endcapping beim 1,7-µm BEH Partikel eröffnet neue Selektivitätsdimensionen, die einen zügigen Abgleich mit der vorhandenen HPLC-Säule zulassen.Nach Auswahl der Phasenchemie erfolgt auf der Grundlage der Analyseziele die Festlegung der Säulendimensionen. Im Allgemeinen greift man auf einen Innendurchmesser (ID) von 2,1 mm zurück, es sei denn, die verfügbare Probenmenge ist gering oder man will den Fluss direkt in ein Massenspektrometer leiten. In diesem Fall ist ein ID von 1,0 mm zu empfehlen. Eine Länge von 100 mm bietet maximale Auflösung. Schnellere Analysen und höherer Probendurchsatz sind mit 50 mm Länge zu realisieren.Skalierung der TrennungNach Wahl der geeigneten Phasenchemie sind als nächstes einige einfache Rechenschritte mit einigen wenigen Gleichungen erforderlich, um die Originalmethode unter Verwendung der exakt gleich zusammengesetzten mobilen Phase geometrisch auf die neue Säule zu skalieren. Diese Gleichungen berücksichtigen die Veränderungen in Gradientenzeit (sofern nicht isokratische Bedingungen gelten), Flussrate und Injektionsvolumen.Die Gradientenskalierung von HPLC auf UPLC erfolgt gemäß:L2/L1 x tg1 = tg2wobei L1 bzw. L2 die Länge der HPLC- bzw. UPLC-Säule ist und tg1 bzw. tg2 die Zeit jedes Gradientenschrittes auf der jeweiligen Säule.Die Skalierung der Flussrate berücksichtigt den Unterschied im Durchmesser der beiden Säulen:(d2)2/(d1)2 x F1 = F2wobei d2 bzw. d1 der Säulendurchmesser ist und F1 bzw. F2 die Flussrate.Um die Säulenvolumina proportional zu halten, sollten die Gradientenschritte mit Blick auf die neue Durchflussrate angepasst werden:(F2 x tg2)/F3 = tg3F2 und tg2 entsprechen der Flussrate und Gradientenzeit der geometrisch skalierten Werte (in der Regel 650 µL/min für kleine Moleküle auf einer Säule mit 2,1 mm ID). F3 und tg3 sind die optimierten Werte.Die Skalierung des Injektionsvolumens berücksichtigt die Volumina der beiden Säulen:V1 x [(d22 x L2)/(d12 x L1)] = V2wobei d2 bzw. d1 dem Säulendurchmesser entspricht, L1 bzw. L2 der Säulenlänge und V1 bzw. V2 dem Injektionsvolumen.Hierzu ein Beispiel: Abbildung 2 zeigt die HPLC-Trennung einer Reihe verwandter Koffeinsäurederivate aus dem Naturprodukt Echinacea Purpurea. Bei Einbeziehung des Säulenneuabgleichs beträgt die Laufzeit mehr als 40 Minuten. Nach korrekter Skalierung von Gradientenzeit, Flussrate und Injektionsvolumen erhält man die in Abbildung 3 dargestellte UPLC-Trennung. Mittels UPLC ist ein chromatographischer Lauf einschließlich Neuabgleich in weniger als sechs Minuten abgeschlossen, was bei weniger als einem Zehntel des Lösungsmittelverbrauchs einer Durchsatzsteigerung um etwa den Faktor sieben entspricht. All das ist möglich ohne wirkliche Veränderungen im Trennungsbild. Gäbe es die Zeitskala in den Abbildungen nicht, wären HPLC- und UPLC-Trennungen kaum voneinander zu unterscheiden. Der Durchsatz steigt also um den Faktor sieben, der Lösungsmittelverbrauch sinkt um den Faktor zehn.Ergänzend sollte angemerkt werden, dass die höhere Geschwindigkeit der UPLC-Trennungen weder die Auflösung noch die Empfindlichkeit beeinträchtigt (Abbildung 4). Die Ausnutzung der Vorteile der geringeren Partikelgröße der Acquity BEH Säulen und der geringen Dispersion des Acquity UPLC-Systems macht es möglich, die Analysezeiten drastisch zu reduzieren und dabei Auflösung und Empfindlichkeit zu erhalten oder sogar zu steigern.Die Temperatur ist ein weiterer beachtenswerter Faktor. Die Umstellung bestehender Methoden macht es erforderlich, die Temperatur konstant zu halten. Konstante Betriebstemperaturen sind für UPLC-Trennungen von besonderer Bedeutung, da kleine Systemvolumina (kleiner 150 µL) weniger Zeit für den Wärmetransfer bieten, sodass eine Vorwärmung essenziell wichtig ist. Aus diesem Grunde wird jedes UPLC-System mit einem Set zur Stabilisierung der Säulentemperatur ausgeliefert und installiert.ZusammenfassungDurch Wahl der richtigen Säule und die Beachtung einiger gut bekannter und anerkannter chromatographischer Prinzipien ist es möglich, HPLC-Methoden direkt und problemlos auf die UPLC umzustellen und auf diese Weise ohne Einbußen bei Auflösung und Empfindlichkeit von den Vorteilen einer enormer Trennungsgeschwindigkeit und eines höheren Probendurchsatzes zu profitieren.Literatur[1] Swartz, M.E. und Sievers, D., Labo 36 (3), 14-19 (2005)[2] Swartz, M.E. und Thomas, C., LaborPraxis 29 (3), 38-41 (2005)[3] Swartz, M.E. in Ultra Performance LC: Separation Science Re-Defined, LCGC Supplement, 5, 14 (2005).[4] Swartz, M.E., American Laboratory 37 (3), 22 (2005)[5] Swartz, M.E. und Murphy, B., J. Liq. Chrom. and Related Tech. 28, 1253 (2005)INFO: SOFTWARE ZUM METHODENTRANSFERWaters bietet auf seiner Homepage die Möglichkeit, mittels einer Software den Transfer einer bestehenden HPLC-Methode auf die UPLC zu simulieren (siehe auch InfoClick). Die Übertragung erfolgt auf Basis der anerkannten Theorie der Flüssigkeitschromatographie, wobei nach Eingabe der aktuellen HPLC-Parameter (u.a. Säulendurchmesser, Säulenlänge, Partikelgröße, Zusammensetzung der mobilen Phase, Flussrate, Temperatur) ein direkter Vergleich der (alten) HPLC-Methode und der (neuen) UPLC-Methode erstellt wird. Darüber hinaus lässt sich das Konzept sowohl auf isokratische Trennungen als auch auf Gradiententrennungen anwenden. Es besteht die Möglichkeit, die Methode entweder hinsichtlich der Auflösung (Effizienz) oder der Geschwindigkeit (Probendurchsatz) oder beider Parameter gleichzeitig zu optimieren. Als professionelle Version dieser Methodentransfer- Software liefert Waters den Acquity UPLC Columns Calculator mit jedem Acquity UPLC-System aus. Die Präzision der Ergebnisse hängt naturgemäß von der Phasenchemie der verwendeten HPLC-Säule ab. Die besten Resultate werden erzielt, wenn die zu übertragende Methode auf XBridge HPLC-Säulen basiert, da die identische Partikelchemie der XBridge HPLC-Säulen und Acquity UPLC-Säulen eine direkte Übertragung der Methoden erlaubt.*Dr. F.-T. Ferse, Customer Education Specialist, Waters GmbH, 65760 Eschborn**Dr. D. Sievers, Program Coordination Manager, Waters GmbH, 65760 Eschborn***Dr. M.E. Swartz, Ph. D., Principal Consulting Scientist, Waters Corporation, Milford/USA

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