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Lichtstreuung

Mizellen und Liposomen mit der Feldflussfraktionierung und Lichtstreuung analysieren

| Autor/ Redakteur: Thomas Jocks* / Dr. Ilka Ottleben

Nanostrukturen wie Mizellen und Liposomen stehen zunehmend im Fokus, wenn es um den gezielten Transport pharmazeutischer und anderer Wirkstoffe geht. Dabei ist eine exakte Charakterisierung der nanostrukturierten Präparate wesentliches Erfolgskriterium. Eine Kombination aus asymmetrischer Feldflussfraktionierung und Mehrwinkel-Lichtstreumessung ist hier Methode der Wahl.

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Abb. 1: Das Wyatt-Eclipse-Partikeltrennsystem mit Dawn-Heleos-Lichtstreugerät sowie Optilab-rEX-Refraktometer (rechts) misst nach dem allgemeinen Trennprinzip der AF4.
Abb. 1: Das Wyatt-Eclipse-Partikeltrennsystem mit Dawn-Heleos-Lichtstreugerät sowie Optilab-rEX-Refraktometer (rechts) misst nach dem allgemeinen Trennprinzip der AF4.
( Bild: Wyatt Europe )

Nanostrukturen wie Mizellen oder Liposomen rücken zunehmend ins Visier der Forschung. Man kann sie einsetzen, um in ihrem Inneren bioaktive Substanzen unterzubringen und geschützt an den gewünschten Wirkungsort zu transportieren. Dieses Vorgehen könnte beispielsweise Nebenwirkungen reduzieren, die bei systemischer Verabreichung von Medikamenten auftreten können. Mizellen bestehen aus amphiphilen Molekülen, weisen also lipophile und hydrophile Bereiche auf und sind dadurch sowohl in polaren (Wasser) als auch unpolaren, organischen Lösungsmitteln löslich. Die runden Nanostrukturen, auch Assoziationskolloide genannt, sind einschichtig und haben einen Durchmesser von 10 bis 30 Nanometer. Bereits seit einiger Zeit gibt es Erfahrungen mit dem Einsatz von Vitaminen und Enzymen, die in Mizellen „verpackt“ als Lebensmittelzusatzstoffe eingesetzt werden.

Anspruchsvolle Analytik

Mizellen, die man als Transportvehikel benutzen möchte, sollten idealerweise eine enge Größenverteilung besitzen. Sie müssen zudem stabil sein und ihre Inhaltsstoffe möglichst nur in der vorbestimmten Zielregion freisetzen. Um diese Eigenschaften sicherzustellen, muss man Mizellenpräparate zuverlässig charakterisieren und ihre Größenverteilung sowie ihre Molmassen mit hoher Genauigkeit bestimmen können. Anhand dieser Daten lässt sich ermitteln, in welchem Umfang die Mizellen tatsächlich bioaktive Komponenten aufgenommen haben.

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Das Trennprinzip der Feldflussfraktionierung

Diese anspruchsvollen analytischen Ziele bedürfen ausgereifter Analysensysteme. So muss man beispielsweise in der Lage sein, das Gemisch aus Mizellen unterschiedlicher Größe mit einem schonenden Verfahren aufzutrennen, damit die empfindlichen Partikel in ihrer ursprünglichen Form erhalten bleiben und nicht zerstört werden. Dies ist mit herkömmlichen Verfahren wie der Größenausschlusschromatographie (SEC, Size Exclusion Chromatography) kaum zu bewerkstelligen, weil die dabei auftretenden Scherkräfte den Strukturen schaden würden. Die asymmetrische Feldflussfraktionierung (AFFFF oder AF4) hingegen ist hier die Methode der Wahl.

Zentrales Element aller AF4-Techniken ist der so genannte Kanal, welchem bei der HPLC die Trennsäule entspricht. Dieser Kanal ist so konstruiert, dass die Elutionsflüssigkeit darin eine laminare Strömung ausbildet: den Kanalfluss. Dieser strömt in der Mitte des Kanals schneller als an seinem Rand. Senkrecht zum Kanalfluss wird ein Querfluss (Cross Flow) angelegt, der die eigentliche Trennkraft auf die Moleküle ausübt. Den Bereich, in dem der Querfluss seine Wirkung entfaltet, bezeichnet man auch als Trennfeld (s. Abb. 2). Befinden sich Analyten im Kanal, so wirkt das Trennfeld auf die Probenbestandteile ein und drückt diese in Richtung der unteren Kanalbegrenzung (Akkumulationswand), die als Fritte konstruiert ist, auf der eine Membran mit definierter Porengröße liegt. Aufgrund der Brownschen Molekülbewegung und ihres hohen Diffusionskoeffizienten diffundieren kleinere Partikel weiter von der Akkumulationswand weg in den Kanal hinein als größere Partikel. Durch die beiden entgegengerichteten Kräfte (Querflusskraft und Diffusionskraft der Moleküle) bildet sich ein dynamisches Gleichgewicht (s. Abb. 2), das in einer definierten Verteilung der Partikelwolken im Kanal resultiert. Partikelwolken von kleinen Teilchen haben dabei im zeitlichen Mittel einen größeren Gleichgewichtsabstand von der Akkumulationswand als Partikelwolken größerer Teilchen (s. Abb. 2, l1 und l2). Folglich befinden sich kleine Partikel im Bereich von schnellen Strömungslinien und werden deshalb früher als große Partikel aus dem Kanal eluiert. Bezogen auf die Teilchengröße ist die Reihenfolge der Elution also umgekehrt zu der einer SEC-Methode. Der potenzielle Trennbereich der Technologie umfasst Analyten in einer Größenordnung von etwa einem Nanometer bis hin zu mehreren Mikrometern.

Charakterisierung von Mizellen mit Lichtstreudetektor

Das AF4-System Wyatt Eclipse (s. Abb. 1) trennt mizellare Strukturen hochauflösend und zerstörungsfrei nach ihrer Größe. Direkt im Anschluss daran übernimmt ein Mehrwinkel-Lichtstreudetektor (MALS) Dawn Heleos die Messung der absoluten Molmasse dieser Partikel. So lässt sich jede der gewonnenen Partikelfraktionen in Bezug auf Radius und Molmasse präzise charakterisieren. Das ermöglicht genaue und verlässliche Aussagen über die Qualität der untersuchten Mizellenpräparation.

Abbildung 3 und 4 zeigen die Messdaten aus drei verschiedenen Mizellenpräparationen, die mit unterschiedlichen aktiven Verbindungen beladen wurden. Aus dem 90°-Lichtstreusignal ist klar ersichtlich, dass auch drei distinkte, in sich relativ einheitliche Fraktionen von Mizellen entstanden sind. Die drei Proben unterscheiden sich allerdings sowohl im Molekülradius (rms, Root Mean Square Radius, mittlerer Trägheits-Radius) als auch im Hinblick auf ihre molare Masse. Der maximale Durchmesser der Partikel liegt nicht über 20 Nanometer und damit in einem für den Anwendungszweck optimalen Bereich.

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