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RÜCKSTANDS- & SPURENANALYTK Multiple flüssig-flüssig-Mikroextraktion für die Altlastenanalytik

| Autor / Redakteur: Thomas Welsch* und Kathrin Spiegel** / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Bei der Spurenbestimmung von polaren Stoffen in durch Rüstungsaltlasten kontaminierten Grundwässern wurde als Alternative zur Festphasen-Extraktion (SPE) an der Universität Ulm eine flüssig-flüssig Mikroextraktionsmethode angewendet, die auf einer mehrfachen Extraktion von bis zu 100 ml Wasser-probe mit sehr geringen Lösungs-mittelmengen in einem Spezialgefäß beruht.

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( Archiv: Vogel Business Media )

Bei der Spurenbestimmung von polaren Stoffen in durch Rüstungsaltlasten kontaminierten Grundwässern wurde als Alternative zur Festphasen-Extraktion (SPE) an der Universität Ulm eine flüssig-flüssig Mikroextraktions-methode angewendet, die auf einer mehrfachen Extraktion von bis zu 100 ml Wasserprobe mit sehr geringen Lösungsmittelmengen in einem Spezial-gefäß beruht. In Verbindung mit einer nachfolgenden GC-MS- oder HPLC-Analyse erwies sich die multiple Mikro-extraktion als kostensparende, einfach durchführbare Probenvorbereitungsmethode, die für sehr polare Stoffe der SPE hinsichtlich Wiederfindung und Bestimmungsgrenze überlegen ist.Nitroorganische Rüstungsaltlasten und deren Transformationsprodukte kontaminieren noch heute stellenweise Boden und Wasser und besitzen ein erhebliches Umweltgefährdungspotenzial [1]. Als Kontaminationsquellen in Deutschland gelten hauptsächlich ehemalige Sprengstoffwerke und Munitionsabfüllanlagen aus der Zeit des 2. Weltkrieges. Durch mikrobiellen oder photochemischen Abbau entstehen aus nitroaromatischen Sprengstoffen je nach Transformationsweg hydroxylierte Produkte oder Aminoaromaten, die oft toxischer als die Ausgangsverbindungen sind und in vielen Fällen mutagene und/oder kanzerogene Eigenschaften besitzen. Deshalb ist ihre analytische Bestimmung, die nach einem Abtrennungs- und Anreicherungsschritt meist mittels HPLC oder Kapillargaschromatographie durchgeführt wird, in extremen Spurenkonzentrationen erforderlich.

Durch die erhöhte Polarität und Wasserlöslichkeit gestaltet sich die Abtrennung und Anreicherung aber besonders schwierig. Zur Probenvorbereitung wird heute in den meisten Laboratorien die Festphasenextraktion (SPE) unter Verwendung von chemisch modifizierten, hydrophoben Kieselgelen oder porösen organischen Polymeren eingesetzt. Bei der Anreicherung sehr polarer Stoffe können sich die kleinen Verteilungskoeffizienten in Verbindung mit geringen Durchbruchvolumina, schlechter Desorbierbarkeit infolge silanophiler Wechselwirkungen und mögliche Kontaminationen durch das Sorbens negativ auf Wiederfindung, Bestimmungsgrenze und Wiederholbarkeit auswirken. Deshalb wurde von uns alternativ zur SPE eine multiple flüssig-flüssig Mikroextraktionsmethode (MLLE) zur Abtrennung und Anreicherung von Explosivstoffen und Transformationsprodukten aus Wasserproben erprobt, die im folgenden vorgestellt werden soll.'

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Prinzip der multiplen flüssig-flüssig Mikroextraktion

Durch Miniaturisierung und Einsatz speziell konstruierter Extraktionsgefäße lassen sich einige Nachteile der klassischen flüssig-flüssig Extraktion (hoher Verbrauch an organischen Lösungsmitteln und damit verbundene ökonomische und ökologische Probleme wie Kosten bei der Anschaffung und Entsorgung und mögliche Schadwirkung für Laborpersonal und Umwelt) vermeiden [2-5]. Der mit sinkendem Volumen des organischen Lösungsmittels verbundene Verlust an Extraktionsausbeute bzw. Wiederfindung lässt sich durch wiederholte Extraktion kompensieren.

Ein Extraktionsgefäß aus Glas für organische Lösungsmittel mit geringerer Dichte als Wasser [4,5], das diese Arbeitsweise erlaubt, ist in Abbildung 1 schematisch dargestellt. Wesentliche Elemente des Extraktionsgefäßes sind das obere verschließbare Steigrohr und der seitliche Ansatz, in dem sich in einer PTFE-Dichtung geführt, ein Glasstempel hin und her bewegen lässt. Nach Füllen des Extraktionsgefäßes mit der gegebenenfalls mit Natriumchlorid gesättigten Wasserprobe bis zum Steigrohr und nach Zugabe von 500 bis 1000 Mikroliter des Extraktions-Lösungsmittels wird der Glasstempel so weit heraus gezogen, dass sich das Extraktionsmittel vollständig im unteren Gefäßraum befindet.

Der eigentliche Extraktionsvorgang wird durch kräftiges Rühren mittels Magnetrührer unterstützt und ist nach etwa 5 Minuten beendet. Nach Phasentrennung wird die organische Phase durch Einschieben des Glasstempels nach oben zurück gedrückt, bis die Phasengrenze im Steigrohr sichtbar wird. Nach Entnahme der oberen organischen Phase können beliebig viele weitere Extraktionsschritte angeschlossen werden. Die Extraktionsausbeute erhöht sich nach der fünften bis sechsten Extraktion selbst für Verbindungen mit kleinem Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten nur noch geringfügig [5]. Die vereinten Extrakte von wenigen Millilitern können anschließend bis zum gewünschten Volumen eingeengt werden.

MLLE versus SPE bei der Analyse von Explosivstoffen

In Abbildung 2 ist die Wiederfindung für die MLLE (siebenmalige Extraktion mit 750 µL tert.-Butylmethylether) der Wiederfindung für die SPE unter Verwendung von speziell für die SPE von Explosivstoffen entwickelten 3M-Empore-Disks gegenübergestellt. Die Analyse wurde mittels Kapillargaschromatographie durchgeführt. Ein GC-MS Totalionenstrom-Chromatogramm einer auf dem Gelände einer ehemaligen Sprengstofffabrik entnommenen Grundwasserprobe, die nach der beschriebenen MLLE Methode aufgearbeitet wurde, zeigt Abbildung 3.

Für Nitrogruppen enthaltende Verbindungen, die weniger polar, weniger basisch und schlechter wasserlöslich sind als reine Aminoaromaten, liegen die Wiederfindungen für beide Extraktionsmethoden zwischen 80 bis 100 Prozent mit etwas besseren Werten für Zweidrittel der untersuchten Verbindungen bei der MLLE. Anilin wird mit der Disk-SPE nicht wiedergefunden, nach der MLLE beträgt die Wiederfindung hingegen 97 Prozent. Für 2,4- und 2,6-Diaminotoluol liegen die Wiederfindungsraten bei beiden Methoden unter 5 Prozent, d.h. die Abbauprodukte der Dinitrotoluole können auf diese Weise nicht analysiert werden.

Trotzdem bietet die MLLE einige Vorteile gegenüber der Disk-SPE. Bei etwa gleichem Zeitaufwand können die Schadstoffe ohne zusätzlichen Anreicherungs- und Extraktionsschritt direkt aus der wässrigen Matrix extrahiert werden. Der Lösungsmittelverbrauch ist etwas geringer als bei der Disk-SPE.

Der gezeigte Vergleich macht deutlich, dass eine Vielzahl der beim mikrobiellen Abbau von nitroaromatischen Explosivstoffen entstehenden Verbindungen, z.B. die Diaminotoluole, ohne Derivatisierung mit einem zur Kapillargaschromatographie kompatiblen Lösungsmittel nur unzureichend angereichert werden können und auf den meisten Kapillarsäulen nur mit starkem Tailing eluieren.

„Salting out extraction“ versus SPE für polare Tranformationsprodukte

Mit der Kombination Reversed Phase Chromatographie - UV-Detektion steht ein alternatives Analysenverfahren zur Verfügung, das für die Bestimmung der polaren Transformationsprodukte sowie für die thermolabilen Sprengstoffe, wie z.B. Tetryl, RDX oder HMX besser geeignet ist als die Kapillargaschromatographie. Zur Anreicherung von Explosivstoffen in Verbindung mit der RP-Chromatographie hat sich die SPE mit LiChrolut-EN (Ethylvinylbenzol-Divinylbenzol-Copolymer, Merck, Darmstadt) oder Bakerbond SDB1 (Styrol-Divinylbenzol-Copolymer, Mallinckrodt Baker, Griesheim) als Sorbens und die Desorption mit Acetonitril (ACN) bewährt.

Bei der Untersuchung sehr gering belasteter Proben ist die UV-Detektion für viele Verbindungen insbesondere die Amino- und Diamino-Verbindungen nicht mehr ausreichend empfindlich. Mit der hochsensitiven und selektiven amperometrischen Detektion (AD) im oxidierenden Modus lässt sich die Empfindlichkeit um den Faktor 50 bis 200 steigern. Nach der SPE an LiChrolut-EN bzw. Bakerbond SDB1 als Sorbens traten jedoch Blindwerte auf, die die amperometrische Detektion gerade im interessanten chromatographischen Bereich erheblich stören (vgl. Abb. 4).

Bei der Suche nach einer kontaminationsfreien Anreicherungsmethode vor der RP-HPLC-AD wurde eine Extraktion der Probenlösung mit ACN unter Ausnutzung einer Mischungslücke („Salting out extraction“, SOE) erprobt, die sich im Mikromaßstab in den beschriebenen Gefäßen durchführen lässt. Hierzu wird die NaCl-gesättigte Probelösung im Verhältnis 5:1 mit ACN gemischt und in das Extraktionsgefäß gefüllt.

Nach der ersten, durch intensives Rühren unterstützten Extraktion scheiden sich 15 Prozent der zugegebenen ACN-Menge als gesonderte Phase ab. Das entspricht einem Volumen von 2 mL ACN bei einem Gesamtvolumen von 80 mL. Für die vorliegenden Untersuchungen wurden sechs weitere Extraktionsschritte mit jeweils 750 µl ACN angeschlossen. Die vereinigten, auf 500 µl eingeengten Extrakte wurden nach Verdünnen mit Eluent direkt in die HPLC dosiert.

Der Vergleich der Wiederfindungen in Abbildung 5 zeigt, dass sich beide Methoden für die meisten Verbindungen sehr gut zur Anreicherung von Explosivstoffspuren eignen. Die nach Aufarbeitung mittels SOE erzielten Wiederfindungsraten bestechen durch ihre Homogenität in einem Bereich von 82-103 Prozent unabhängig von den physikalischen Eigenschaften der Komponenten. Für sehr polare Komponenten ist die SOE der SPE deutlich überlegen.

Die stark saure Pikrinsäure wird aus neutraler Lösung ebenso gut extrahiert wie das basische 2,4-Diamino-6-nitrotoluol oder das neutrale 2,4,6-Trinitrotoluol. Auch das schwer anzureichernde Tetryl wird nach SOE mit 97 Prozent wiedergefunden. Für die Diaminotoluole werden immerhin noch Wiederfindungen über 75 Prozent erzielt. Die auftretenden Blindwerte bei der SPE ließen die Bestimmung der (geringen) Wiederfindung für 2,4- und 2,6-Diaminotoluol nicht zu.

Mit der SOE als Probenvorbereitungsmethode konnten die Gehalte von nitroorganischen Explosivstoffen und ihren Transformationsprodukten in Realproben im ppb- und sub-ppb-Bereich zuverlässig bestimmt werden.

MLLE und „Salting out extraction“bieten ideale Alternative zur SPE

Für die Abtrennung und Anreicherung von nitroorganischen Rüstungsaltlasten und deren Transformationsprodukten aus wässrigen Matrizes stellt die in diesem Beitrag vorgestellte multiple flüssig-flüssig Mikroextraktion bzw. „Salting out extraction“ mit Acetonitril eine ideale Alternative zur Festphasenextraktion dar.

Sie ist sowohl für weniger polare Verbindungen, die gaschromatographisch untersucht werden sollen, als auch für polare Verbindungen mit nachfolgender HPLC-Analytik sehr gut geeignet, ohne dass die Nachteile der klassischen Lösungsmittelextraktion in Kauf genommen werden müssen. Auch andere, in Spurenkonzentrationen zu bestimmende polare Stoffe in wässrigen Matrices sollten mit dieser Methode gut zu extrahieren und anzureichern sein. Dadurch eröffnen sich für die MLLE und SOE zahlreiche weitere Anwendungsgebiete.

Die Autoren:Prof. Dr. Thomas Welsch*:1971 Chemie-Studium und Promotion an der Universität Leipzig; bis 1991 Tätigkeit als Wissenschaftlicher Oberassistent und Dozent auf dem Fachgebiet Analytische Chemie/Chromatographie an der Universität Leipzig, Habilitation über Hochleistungstrennsäulen in der Chromatographie. Seit 1991 Professor für Analytische Chemie an der Universität Ulm.Dr. Kathrin Spiegel**:1995 Chemie-Studium und Diplomarbeit an der Universität Ulm; 1995–1998 Doktorarbeit am GKSS Forschungszentrum in Geesthacht. Seit 1999 Tätigkeit auf den Gebieten Qualitätssicherung, Prüfleitung, Reporting und Validierung bei der Dr. Knoell Consult GmbH, Bayer CropScience AG, Monheim.

*Universität Ulm, Abt. Analytische Chemie und Umweltchemie, 89069 Ulm**Dr. Knoll Consult GmbH, Weinheimer Str. 64, 68309 Mannheim

Literatur:[1] U. Dornberger, T. Welsch, Explosivstoffe in Altlasten der Rüstungsproduktion, UWSF-Z. Umweltchem. Ökotox. 7 (1995) 302-316.[2] R. M. Smith, Before the injection – modern methods of sample preparation for separation techniques, J. Chromatogr. A, 1000 (2003) 3-27.[3] I. Peleg, S. Vromen, An efficient novel device for solvent extraction, Chem. Ind.1983, 615-616.[4] W. Dünges, H. Muno, F. Unckell, Rationelle prächromatographische Mikromethoden für die ppb- und ppt-Analytik, DVGWSchriftenreihe Wasser Nr. 108, 1990[5] T. Welsch, H. Block, Separation and enrichment of traces of explosives and their by-products from water by multiple micro liquid extraction for their determination by capillary gas chromatography, Fresenius J. Anal. Chem. 357 (1997) 904-908.

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