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Rückstandsanalytik Nachweis von Malachitgrün mittels SPE und LC/MS

Autor / Redakteur: Norbert Helle*, Martina Bohlje*, ?Jürgen Wendt**, Frederick D. Foster*** ?und Carlos Gil**** / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Obwohl Malachitgrün (MG) für die Behandlung tierischer Lebensmittel in der EU verboten ist, stoßen chemische Untersuchungsämter bei Routine-Überprüfungen von Aquakulturen immer wieder auf Rückstände der gesundheitsschädlichen Verbindung. Experten von Gerstel, TeLA und Agilent Technologies ist es gelungen, den Nachweis von Malachitgrün und seines Metaboliten Leukomalachitgrün (LMG) mittels LC/MS zu sensitivieren. Dank automatisierter Festphasenextraktion, kurz SPE, konnte er zudem effizienter gestaltet werden.

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Abb.1 Der Triphenylmethanfarbstoff Malachitgrün findet traditionell Verwendung, um Aquakulturen vor Pilzinfektionen zu schützen.
Abb.1 Der Triphenylmethanfarbstoff Malachitgrün findet traditionell Verwendung, um Aquakulturen vor Pilzinfektionen zu schützen.
( Archiv: Vogel Business Media )

Der Triphenylmethanfarbstoff Malachitgrün (MG) bekämpft wirksam Pilze, Bakterien und Einzeller. MG steht allerdings auch im Verdacht, das Erbgut zu verändern und Krebs auszulösen, gelangt der Wirkstoff über den Konsum kontaminierter Lebensmittel in den menschlichen Organismus. Traditionell wird Malachitgrün eingesetzt, um Aquakulturen vor Pilzinfektionen zu bewahren oder sie zu behandeln. Einmal im Fischorganismus angekommen, wird MG zu Leukomalachitgrün (LMG) reduziert und im Fettgewebe eingelagert. Fisch, der mit MG kontaminiert ist, sollte aufgrund des erheblichen Gesundheitsrisikos nicht verzehrt werden. 2003 hat die EU-Kommission zwei Mikrogramm pro Kilogramm als höchstzulässigen Grenzwert für MG und LMG festgesetzt. Dank einer neuen Methode gelingt es, beide Substanzen sensitiv und effizient nachzuweisen. Grundlage bildet ein LC/MS-Iontrap-System von Agilent in Kombination mit dem Multi-Purpose-Sampler (MPS) von Gerstel.

Probenvorbereitung

Eine Fischfiletprobe wird homogenisiert, mit einer Lösung von Acetonitril und Wasser extrahiert und zentrifugiert. Der flüssige Überstand wird entnommen und gesammelt. Dieser Extraktionsvorgang wird zweimal wiederholt. Die gesammelten Extrakte werden eingedampft und der Rückstand mit einer Mischung aus Methanol und Wasser aufgenommen. Die Aufreinigung der Probe erfolgt mittels Festphasenextraktion (SPE) automatisch in einem Gerstel-Multi-Purpose-Sampler (MPS).

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Nachweis mit der LC/MS-Methode

Der MPS war integriert in ein Agilent 1100 LC/MS-Iontrap-System, bestehend aus Binärpumpe, thermostatisiertem Säulengehäuse, Dioden-Array-Detektor und einem XCT+-Iontrap-MS. Das LC/IT-MS wurde mit Elektronenspray-Ionisierung im Positiv-Ionen-Modus verwendet. Das für alle Analysen verwendete Injektionsvolumen betrug fünf Mikroliter. Die Trennungen erfolgten auf einer Zorbax SB-C18-Säule (50 x 2,1 mm, 1,8 µm) mit einer Flussrate von 0,6 Milliliter pro Minute im Gradientenmodus (Eluat A: 0,1 Prozent Ameisensäure, Eluat B: Acetonitril). Die Säule war auf 50 °C temperiert. Die vollständige Systemsteuerung, einschließlich Probenvorbereitung, LC/MS-Analyse und Datenbearbeitung, erfolgte mit der Gerstel-Maestro-Software, eingebunden in die Chemstation von Agilent Technologies (Rev. A10.03).

Ergebnis und Diskussion

Malachitgrün (MG) und sein Metabolit Leukomalachitgrün (LMG) lassen sich mittels Elektronensprayionisation (ESI) im Positiv-Ionen-Modus leicht ionisieren. Im Gegensatz zu MG bildet LMG ein doppelt geladenes Ion (m/z 166) zusätzlich zum einfach geladenen molekularen Ion [M-H]+ (Abb. 3). Das ist auf die nicht-planare sterische Struktur des zentralen Kohlenstoffs in der Leukoform zurückzuführen (Abb. 4).

Im MS2-Modus der Ionenfalle bildet das MG-Vorläuferion ein Produkt (m/z 313), während der doppelt geladene LGM-Vorläufer ein Molekülfragment bildet, das auch doppelt geladen ist. Der Übergang ist hochsensitiv und lässt sich für die äußerst sensitive LMG-Analyse nutzen. Unter Verwendung beider Übergänge ließen sich Bestimmungsgrenzen von 0,5 Mikrogramm pro Kilogramm für MG und 0,05 Mikrogramm pro Kilogramm für LMG verwirklichen.

Die automatisierte SPE in direkter Kopplung mit dem LC/MS-System garantiert hohe Wiederfindung, im äußersten Fall 90 Prozent, und eine sehr gute Reproduzierbarkeit der Probenvorbereitungsschritte. Zudem erfordert die automatisierte Probenvorbereitung nur etwa 50 Prozent der Zeit, die für die manuelle Vorgehensweise zu veranschlagen gewesen wäre.

Fazit

Das beschriebene automatisierte SPE- und LC/IT-MS-System ermöglicht es, die Probe automatisiert aufzureinigen und das Extrakt direkt zu analysieren. Die Methode lässt sich leicht und den individuellen Erfordernissen entsprechend per Mausklick aus einem übersichtlichen Menü zusammenstellen und anschließend automatisch aus der Chemstation von Agilent Technologies heraus ausführen. Dank der Aufreinigung lassen sich störende Matrixbestandteile aus dem Extrakt entfernen. Dies führt zu einer erheblich besseren MS-Response und niedrigeren Detektionslimits. Die Methode ist robust und stabil (relative Standardabweichung 3,4 bis 5,3 Prozent) und garantiert eine gute Wiederfindung (89,5 bis 90,3 Prozent).

Hintergrund Malachitgrün – Problematischer Vielseiter

Malachitgrün gehört chemisch zu der Gruppe der Triphenylmethane und findet vorwiegend Verwendung als synthetischer Farbstoff, etwa in der Lackherstellung. Daneben stellt Malachitgrün aber auch ein hochwirksames Desinfektionsmittel dar und vermag äußerst effektiv verschiedene Parasiten (Pilze, Bakterien, Einzeller) zu bekämpfen, die Fische und Fischeier befallen. Es wird oft in der Zierfischmedizin eingesetzt, insbesondere gegen die Weißpünktchenkrankheit.

Malachitgrün steht jedoch im Verdacht, krebserregend und erbgutschädigend zu sein. Zur Vermeidung einer möglichen gesundheitlichen Gefährdung des Verbrauchers ist konsequenterweise eine Anwendung von Malachitgrün als Tierarzneimittel bei Lebensmittel-liefernden Tieren EU-weit verboten.

In Baden-Württemberg wurden im Jahr 2005 insgesamt 336 Proben (See-, Süßwasserfische und Forellenkaviar) auf Triphenylmethanfarbstoffe untersucht. In 44 Forellen-Proben und einer Probe Pangasius wurde Leukomalachitgrün, das Hauptstoffwechselabbauprodukt von Malachitgrün, nachgewiesen. Die ermittelten Gehalte reichten von 2 bis über 100 μg/kg. Eine Forellenprobe enthielt zusätzlich auch noch Malachitgrün (1,5 μg/kg).

Die hohe Zahl von Untersuchungen und positiven Proben beruht im Wesentlichen darauf, dass bei drei Erzeugerbetrieben Forellen aus allen Teichen untersucht worden waren, nachdem bei Stichprobenuntersuchungen Rückstände von Malachitgrün festgestellt wurden. Alle Proben mit festgestellten Rückständen von Leukomalachitgrün wurden beanstandet.

Quelle: Überwachung von Lebensmitteln, Bedarfsgegenständen, Kosmetika und Futtermitteln, Jahresbericht 2005, Ministerium für Ernährung und Ländlichen Raum Baden-Württemberg

* Dr. N. Helle und M. Bohlje, TeLA GmbH, 27572 Bremerhaven** Dr. J. Wendt, Agilent Technologies, 76337 Waldbronn*** F.D. Foster, Gerstel Inc., Baltimore/USA**** C. Gil, Gerstel GmbH & Co. KG, 45406 Mühlheim an der Ruhr

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