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Mikroorganismen

Neue Ausgangsstoffe und Produkte aus der Zellfabrik

| Autor / Redakteur: Petra Peters-Wendisch* und Sabine A. E. Heider* / Marc Platthaus

Abb.1: Kultur des Corynebacterium-glutamicum-Bakteriums. (Bild: FZ Jülich)
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Abb.1: Kultur des Corynebacterium-glutamicum-Bakteriums. (Bild: FZ Jülich)

Die Nutzung von Mikroorganismen gewinnt in der Chemie immer mehr an Bedeutung. Vor allem Produkte, die petrochemisch nicht zugänglich sind und auf Basis nachwachsender Rohstoffe fermentativ hergestellt werden können, rücken in den Fokus.

Bakterien sind klein, passen sich flexibel an viele verschiedene Umweltbedingungen an, weisen einen nicht zu komplexen Aufbau auf und lassen sich in großen Mengen aus einer einzigen definierten Ursprungszelle reproduzieren. Mit diesen Eigenschaften dienen sie bereits seit Jahrzehnten als Grundlage für die Herstellung von Wertstoffen in der weißen Biotechnologie. Für die Erzeugung neuer Produkte mithilfe von Bakterien ist eine effiziente Stammentwicklung, vor allem aus ökonomischer Sicht, ausschlaggebend. Dafür ist das Metabolic Engineering unverzichtbar geworden, da es einen rationalen Ansatz bei der Stammentwicklung ermöglicht. Früher wurden auf Basis ungerichteter Mutationen und einem anschließenden Screening oder durch Selektion Produktionsstämme erzeugt, die aber häufig unerwünschte „Krankheiten“ aufwiesen, wie z.B. Auxotrophien für bestimmte Vitamine oder Aminosäuren. Den Durchbruch hin zur gerichteten Veränderung des Stoffwechsels gelang durch das Metabolic Engineering. Hierunter versteht man die Verbesserung der zellulären Aktivität durch Manipulation der enzymatischen und regulatorischen Funktionen sowie der Transporteigenschaften der Zelle unter Verwendung von gentechnischen Methoden.

Durch den Einsatz der Omics-Methoden wurde das Metabolic Engineering weiterentwickelt und der reduktionistische, auf wenige Gene oder Enzyme beschränkte Blickwinkel überwunden. Das Genom-basierte Metabolic Engineering verfolgt heutzutage einen Gesamtzell- also systemweiten Ansatz [1]. Genom-, Proteom-, Transkriptomanalysen, sowie biochemische Untersuchungen leiten die rationale Deregulierung oder Umleitung von Stoffwechselwegen zur Optimierung der Stoffproduktion. Darüber hinaus hat die Sequenzierung einer mittlerweile riesigen Anzahl bakterieller Genome ein erhebliches genetisches Potenzial gehoben, dass für die heterologe Expression genutzt werden kann. Es gelingt ganze Biosynthesewege von einem Organismus auf einen anderen zu übertragen, oder aus Teilschritten ganz neue Biosynthesewege zu generieren. Der gezielte Transfer oder die Neu-Kombination von Stoffwechselwegen bzw. Teilen davon wird zur Synthetischen Biologie gezählt [2].

Entwicklung und Optimierung einer Zellfabrik

Corynebacterium glutamicum ist ein Arbeitspferd der Biotechnologie und wird für die biotechnologische Aminosäureproduktion im Millionen-Tonnen-Maßstab bereits seit Jahrzehnten eingesetzt [3]. Es wurde in den 1950iger Jahren als Glutamat-Produzent entdeckt und seither kontinuierlich weiterentwickelt. Zunächst wurde die Eigenschaft, Glutamat über C. glutamicum zu produzieren, durch klassische Mutagenese und Screening gestärkt. Ebenso gelang es auf diese Weise Lysin-produzierende Stämme zu entwickeln [4]. Beispiele für den erfolgreichen Einsatz des Metabolic Engineering zur Herstellung eines neuen Produkts für die weiße Biotechnologie ist die rationale Entwicklung von Stämmen für die Produktion der Aminosäure L-Serin und des 1,4-Diaminobutan, einem Vorläufer der Polyamid-Herstellung. Die besondere Herausforderung bei der Konstruktion eines C. glutamicum-Produktionsstamms für die Aminosäure L-Serin lag darin, dass Serin kein Endprodukt im Stoffwechsel ist, sondern als Vorläufer für viele wichtige Biosynthesen, so z.B. für den gesamten C1-Stoffwechsel der Zelle fungiert. Dennoch gelang es, auf Basis einer rationalen Vorgehensweise einen Serin-Produktionsstamm zu erzeugen. In mehreren aufeinanderfolgenden Schritten wurde durch gezielte genetische Veränderungen:

  • der Biosyntheseweg für Serin durch Überexpression der Stoffwechselgene verstärkt,
  • das entsprechende Schlüsselenzym dereguliert,
  • der Abbau von Serin verhindert bzw. minimiert,
  • sowie die Vorstufenbereitstellung verbessert.

Diese genetischen Veränderungen führten dazu, dass ausgehend vom C. glutamicum-Wildtyp, der kein Serin bildet, ein Produktionsstamm erzeugt wurde, mit dem bis zu 90 mM Serin produziert werden kann [5]. Neben den Aminosäuren lassen sich aber auch Aminosäure-Derivate, wie z.B. 1,4-Diaminobutan mit C. glutamicum herstellen. 1,4-Diaminobutan leitet sich aus dem Arginin-Stoffwechsel ab, und zunächst wurde der Stoffwechsel in Richtung Arginin-Biosynthese umgelenkt, indem der Repressor der Arginin-Biosynthese genetisch ausgeschaltet wurde. Die Deletion des Gens eines zur 1,4-Diaminobutan-Synthese konkurrierenden Enzyms kombiniert mit der heterologen Expression eines Gens Aminosäure-Decarboxylase aus E. coli führte direkt zum Produkt 1,4-Diaminobutan mit einer Ausbeute von 19 g/l [6].

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