Biologische Proben unterhalb der Lichtwellenlänge messen Zufallsfund führt zu neuem Brechungsindex-Mikroskop

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Sie machten aus einem Messproblem eine neue Mikroskopiemethode. Forscher der TU Wien haben Einzelmolekül-Mikroskopie mit Rasterkraftmikroskopie kombiniert, um nun präzise den variablen Brechungsindex in biologischen Proben zu messen.

Eigentlich wollte ein Team der technischen Universität Wien lediglich biologische Proben auf molekularer Skala untersuchen, stieß dabei aber auf hartnäckige Probleme. Die Ursache für die Messungenauigkeit war schnell identifiziert: der variable Brechungsindex der Probe. Doch dann stellten die Wissenschaftler fest, dass dieser sich exakt ermitteln lässt und damit selbst zum hochinteressanten Messergebnis wird. Alles, was dafür nötig ist, sind zwei grundlegend verschiedene Mikroskopie-Methoden in Kombination.

Beinahe zufällig gelang es an der TU Wien auf diese Weise, eine neue Mikroskopie-Technik zu entwickeln. Die den Brechungsindex biologischer Proben misst – und zwar mit einer Auflösung weit unterhalb dessen, was Lichtmikroskopie nach herkömmlicher Theorie erlauben dürfte.

Das Limit klassischer Lichtmikroskopie

Um die neue Messmethode zu verstehen, ist folgende Frage wichtig: Was passiert, wenn man zwei Moleküle fotografieren möchte, deren Abstand kleiner ist als die Wellenlänge des Lichts? Die kurze Antwort lautet: es geht nicht, zumindest nicht mit herkömmlichen Lichtmikroskopen. Statt zwei getrennten Punkten ergibt sich ein einzelner Lichtfleck – die Bilder der beiden Moleküle überlagern sich. Denn die Grenze der Auflösung ist bestimmt durch die Wellenlänge des Lichts. Gemäß der so genannten Abbe-Regel liegt das Auflösungslimit etwa bei der Hälfte der eingesetzten Wellenlänge, also bei rund 200 bis 300 Nanometer für sichtbares Licht.

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Über die Grenzen der Auflösung hinaus

Es gibt aber eine Möglichkeit, diese Grenze zu überschreiten: die Einzelmolekül-Mikroskopie. Dabei baut man gezielt spezielle Moleküle in die Probe ein, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten blinken. Jedes von ihnen erzeugt in der Kamera eine kleine Lichtscheibe. Durch Bestimmen des Zentrums dieser Scheibe lässt sich sehr genau ermitteln, wo das Molekül tatsächlich sitzt, und zwar auch, wenn sich ein anderes Molekül innerhalb derselben Scheibe befindet. Da die Moleküle nacheinander aufleuchten, können sie getrennt voneinander gemessen und präzise abgebildet werden. Wären die Bilder von zwei so eng beisammen liegenden Molekülen in einem gewöhnlichen Mikroskopieaufnahme miteinander verschwommen, so erlaubt die Einzelmolekül-Mikroskopie extrem hochauflösende Abbildungen.

„Die Lichtscheiben, die man auf diese Weise misst, sind allerdings nicht immer gleich groß“, sagt Prof. Gerhard Schütz vom Institut für Angewandte Physik der TU Wien. „Die Größe der Lichtscheibe hängt etwa davon ab, wie nahe sich das Molekül an der Fokusebene der Kamera befindet.“ Ursprünglich wollte man genau dieses Phänomen als Informationsquelle nutzen: Wenn man aus der Größe der Lichtscheiben den Abstand des Moleküls ermitteln könnte, dann ließe sich theoretisch aus den Lichtscheiben ein 3D-Bild erzeugen. Doch bald zeigte sich: Ganz so einfach ist das nicht.

„Das Problem ist, dass die Größe der Lichtscheiben auch vom Brechungsindex des Materials abhängt“, erklärt Schütz. Nicht jedes Material lässt Lichtstrahlen gleich schnell passieren. Genau dieser Effekt führt dazu, dass Prismen oder Linsen Licht ablenken. Man hat also zwei Parameter, die einen Einfluss auf den gemessenen Lichtfleck haben können – Abstand und Brechungsindex.

Ändert sich der Abstand – oder der Brechungsindex?

Doch was ist, wenn man aus dieser Not eine Tugend macht? „Wir entschlossen uns, dieses Problem einfach umzukehren“, sagt Schütz. „Wir messen die 3D-Struktur unserer Probe einfach auf andere Weise, nämlich mit einem Rasterkraftmikroskop. Dann können wir unsere Lichtaufnahme verwenden, um punktgenau an jeder Stelle unserer Probe den Brechungsindex zu berechnen.“

So entwickelte das Team der TU Wien in Kooperation mit der Medizinischen Universität Innsbruck eine Technik, mit der man den Brechungsindex biologischer Proben auf einer Skala deutlich unterhalb der Lichtwellenlänge messen kann.

„Das ist gerade bei Kollagen im Gewebe höchst spannend“, sagt Schütz. „Kollagen kann unterschiedliche Mengen von Wasser aufnehmen, dementsprechend ändert sich auch der Brechungsindex. Mit unserer Methode kann man nun punktgenau bestimmen, wie viel Wasser sich an welcher Stelle befindet. Auch über die chemische Zusammensetzung des Gewebes können wir Daten erhalten, die bisher nicht direkt zugänglich waren.“

Entstanden ist schließlich – ausgelöst durch eine fast zufällige Entdeckung – eine neue Verbindung zwischen physikalischer Messtechnik und mikrobiologischer Forschung.

Die Forschungen wurden vom Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung (FWF) und dem Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung und der Wiener Wissenschafts-, Forschungs- und Technologiefonds (WWTF) gefördert. Grundlage war eine Kollaboration zwischen dem Institut für Angewandte Physik und dem Institut für Leichtbau und Struktur-Biomechanik der TU Wien sowie dem Institut für Biomedizinische Physik der Medizinischen Universität Innsbruck.

Originalpublikation: S. Jaritz et al.: Refractive Index Mapping below the Diffraction Limit via Single Molecule Localization Microscopy, ACS Nano 2026, 20, 1, 1335–1344; DOI: 10.1021/acsnano.5c17647

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