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Freie Software für die Partikelanalytik Open Source Software für schnelles Mikroplastik-Monitoring

Von Dr. Elisavet Kanaki*, Dr. Josef Brandt**, Robert Ohmacht***, Dr. Franziska Fischer*, Dr. Dieter Fischer*

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Das Monitoring von Mikroplastik in Umwelt und Lebensmitteln erfordert schnelle und zuverlässige Analysemethoden, wie die FTIR- und Raman-Spektroskopie. Eine neue Software bietet eine semi-automatische Lösung für die korrelative optische und spektroskopische Mikroskopie und Auswertung, die dank freier Lizenz von jedem an die eigenen Anforderungen angepasst werden kann.

Mikroplastik ist heute in den entlegensten Winkeln unserer Erde zu finden. Über die Nahrungskette gelangt es auch wieder auf unseren Tellern (Symbolbild)
Mikroplastik ist heute in den entlegensten Winkeln unserer Erde zu finden. Über die Nahrungskette gelangt es auch wieder auf unseren Tellern (Symbolbild)
(Bild: ©dottedyeti - stock.adobe.com)

Kleine Partikel, großes Problem – Mikroplastik ist heute in den entlegensten Winkeln unserer Erde zu finden. Die Definition von Mikroplastik ist mittlerweile den meisten bekannt: Kunststoff­partikel kleiner als 1 mm (oder nach älterer Definition: kleiner als 5 mm), die entweder durch Alterungsprozesse aus größerem Plastikmüll, durch industrielle Prozesse oder in der Nutzungsphase von Kunststoffen entstehen. Dieses Mikroplastik kann unkontrolliert in die Umwelt gelangen.

Was noch vor einem Jahrzehnt Forschungsthema weniger Wissenschaftler war, ist inzwischen in der öffentlichen Wahrnehmung angekommen. Dabei verschiebt sich der Fokus von der reinen Umweltverschmutzungsproblematik auf die potenziellen Risiken, die Mikroplastik für die Gesundheit von Tierwelt und Menschen birgt. So befassen sich immer mehr Untersuchungen mit der Bestimmung des Gehaltes von Mikroplastik in Trinkwasser und Nahrungsmitteln. Auch die Lebensmittel- und Verpackungsindustrie wird zunehmend dem Thema gegenüber sensibilisiert, wie das große Interesse an dem im Juli 2021 gestartetem Cornet-Projekt microplastic@food zeigt [1]. Das Thema ist ebenfalls schon seit einiger Zeit im Fokus der Europäischen Behörde für Lebensmittelsicherheit (Efsa) [2].

Aber auch das Monitoring von Quellen, Senken und Transportwegen von Mikroplastik in der Umwelt (Böden, Flüsse, Klärwerke, Meere, Atmosphäre) ist weiterhin relevant, damit dem Einbringen von Mikroplastik in die Umwelt möglichst effizient entgegengewirkt werden kann.

LP-Info: Open Source und anpassbar

Veröffentlicht unter der GNU General Public License v3.0 [7] kann die Software Gepard nicht nur kostenfrei verwendet, sondern auch von jedem weiterentwickelt und an seine individuellen Analytikanforderungen bzw. sein spezifisches Mikroskop angepasst werden. Durch die gemeinsame Nutzung des Codes mit anderen Gruppen lässt sich das Programm auch jederzeit weiter optimieren.

Welche Methode?

Obwohl im Prinzip Mikroplastik mit einer Vielfalt von analytischen Methoden bestimmt werden kann, ist nur eine Handvoll von ihnen reif für den Einsatz in der Routineanalytik. Außerdem ist die genaue Fragestellung ausschlaggebend für die Wahl der geeigneten Methode.

In den allermeisten Fällen ist nicht nur die chemische Information, um welchen Kunststoff es sich handelt, sondern auch die Größenverteilung und Form des Mikroplastiks von Interesse, da die Partikelgröße eine entscheidende Rolle bei der Aufnahme durch Organismen spielt.

Für solche Fragestellungen kommen prinzipiell spektroskopische Methoden, wie die FTIR- und Raman-Spektroskopie in Frage. Man verwendet dabei entweder Imaging-Methoden oder eine korrelative optische und spektroskopische Mikroskopie, sowohl für die Raman- als auch die FTIR-Spektroskopie. Optische Mikroskopie ist dabei die Methode der Wahl, um möglichst genau Größe und Form der mikro­skopischen Partikel zu bestimmen. Mit der FTIR- und/oder der Raman-Spektroskopie bestimmt man die Kunststoffart. Die Korrelation der optischen Information mit der Raman- oder FTIR-Mikroskopie ergibt dann ein vollständiges Bild zum Mikroplastikgehalt der Probe.

Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die zu analysierende Größenordnung: Partikel bis 10 µm können sowohl mit FTIR- als auch mit Raman-Mikroskopie identifiziert werden, darunter bis 1 µm kann nur mit der Raman-Spektroskopie gemessen werden.

Probenvorbereitung

Vor der Analyse der Probe muss die zu untersuchende Probe vorbereitet werden. Diese Vorbereitung dient dazu, die Matrix und möglichst viele andere feste Anteile zu entfernen. Das können je nach Probe anorganische Stoffe, wie Sand, organische Anteile, wie Partikel pflanzlichen Ursprungs, oder das zu untersuchende Lebensmittel sein. Die Separation gelingt mittels Dichteseparation und chemischer sowie enzymatischer Aufarbeitung [3]. Wie aufwändig die Protokolle für diese Aufarbeitung sind – und wie effektiv – hängt stark von der Matrix ab: Trinkwasser ist ein einfacher Fall, feste Lebensmittel oder Bodenproben sind deutlich schwieriger aufzuarbeiten.

Nach der Aufarbeitung wird die Probe als wässrige Dispersion (bei Bedarf fraktioniert) auf geeignete Filtermaterialien (z. B. Siliziumwafer mit definierten Löchern) filtriert, die im Infrarotbereich transparent sind und somit als Substrate für FTIR- und Ramanmessungen optimal geeignet sind. Das Labor und die darin verwendeten Apparaturen sollten dabei weitestgehend kunststofffrei sein. Zusätzlich muss zur Qualitätssicherung für jede Probe eine Blindprobe mit Reinstwasser filtriert werden.

Auch nach sorgfältiger Aufarbeitung enthält eine typische, auf Mikroplastik zu untersuchende Probe zwischen 1.000 und 40.000 Partikel pro Filter. Eine Automatisierung des Mess- und Auswertungsprozesses ist somit notwendig.

Analytik per Software

Gepard (Gepard-Enabled Particle Detection) ist eine frei verfügbare Open-Source-Software für die automatisierte Partikelanalytik mittels korrelativer optischer und spektroskopischer Raman- oder FTIR- Mikroskopie [4, 5]. Sie wird von der Forschungsgruppe Spektroskopie und Mikroplastik im Leibniz-Institut für Polymerforschung Dresden e. V. entwickelt, deren langjährige Erfahrung im Bereich der Mikroplastikanalytik im Design und in die Weiterentwicklung des Programms einfließt [6].

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Eine typische Messung mit Gepard besteht aus drei Teilen: Der optischen Aufnahme und Partikel­erkennung hinsichtlich Form und Größe, der Messung mit dem FTIR- oder Raman-Mikroskop, und der Möglichkeit der Nachbearbeitung der Ergebnisse.

Abb. 1: Wasserprobe aus der Warnow auf zwei 50-µm-Silizium-Filter verteilt (Größe des Filters: 11 mm). In der Dunkelfeldaufnahme wird die Morphologie der Partikel optimal erkannt.
Abb. 1: Wasserprobe aus der Warnow auf zwei 50-µm-Silizium-Filter verteilt (Größe des Filters: 11 mm). In der Dunkelfeldaufnahme wird die Morphologie der Partikel optimal erkannt.
(Bild: Leibniz-Institut für Polymerforschung Dresden (ipf))

Im ersten Schritt wird im optischen Mikroskop eine Reihe von Bildern auf mehreren Fokusebenen aufgenommen – aus den Einzelbilder wird ein tiefenscharfes Bild des Filters zusammengesetzt. Mit diesem Bild wird die Partikelerkennung durchgeführt. In einer Dunkelfeldaufnahme, wie in Abbildung 1, wird die Partikelmorphologie (z. B. Farbe) genauer als im Hellfeld dargestellt. Die Partikelerkennung kann aber in beiden Fällen durchgeführt werden. Sie basiert auf Algorithmen der Bildbearbeitung, wie Kontrastanpassung und Unschärfefilter; durch Watershed-Transformation werden sehr nah beieinanderliegende oder überlappende Partikel voneinander getrennt. Ein Satz von Parametern, die die Partikelerkennung steuern, wird dem Benutzer präsentiert, um den Algorithmus an jede Probe anzupassen. Darüber hinaus ist die manuelle Bearbeitung einzelner Partikel (z. B. Trennung/Kombination/Zufügen/Entfernen von Partikeln) möglich.

So werden zeitgleich zwei Ziele erreicht: Die Morphologie der Partikel wird sehr genau erkannt und für jeden Partikel werden Messkoordinaten (x,y,z) bestimmt. Bei einer FTIR-Messung werden auch die Aperturgrößen für jedes Partikel definiert.

Als nächstes werden die ermittelten Partikelkoordinaten der Steuersoftware des Mikroskops für die FTIR- bzw. Raman-Messung über­geben und die Messung wird automatisiert durchgeführt.

Die Messspektren werden aktuell mit einem externen Programm und kommerziellen, sowie selbsterstellten Datenbanken identifiziert und Polymerarten zugeordnet. Die Auswertung der Ergebnisse wird vom Modul Gepardevaluation übernommen. Die Informationen aus der Partikelerkennung werden mit den gemessenen Spektren sowie mit der Spektrenzuordnung korreliert.

Abb. 2: Mit dem Partikelnavigator können die Partikel nach Material gesichtet, und wenn nötig ihre Angaben korrigiert werden.
Abb. 2: Mit dem Partikelnavigator können die Partikel nach Material gesichtet, und wenn nötig ihre Angaben korrigiert werden.
(Bild: Leibniz-Institut für Polymerforschung Dresden (ipf))

Besonders nützlich sind in Gepard die vielfältigen Nachbearbeitungsmöglichkeiten für die Auswertung des Datensatzes. Mit dem Steuerungsfenster Partikelnavigator (s. Abb. 2) können die Partikel im optischen Bild einschließlich aller dazugehörigen Daten und Spektren durchgesehen werden. Bei Notwendigkeit kann die Zuordnung, die Farbe, oder die Form des Partikels vom Anwender geändert werden. Außerdem können Partikel zusammengefügt oder ihre Grenzen komplett neu definiert werden, was insbesondere für die Definition von Fasern wichtig ist. Das kann v. a. im Fall von besonders dicht mit Partikeln besetzten Filtern von Vorteil sein. Das automatische Ergebnis der Partikelerkennung kann dadurch verbessert werden. So wird gewährleistet, dass die im nächsten Schritt ausgegebene Statistik über die gesamte Probe korrigierbar und genau ist.

Die Ergebnisse der Auswertung können entweder exportiert oder direkt in Datenbanken hochgeladen werden. Nach Bedarf werden Informationen wie die Dimensionen, Zuordnung, Form und Farbe für jedes Partikel ausgegeben, sowie eine Zusammenfassung nach Polymerart und Größenverteilung. Hierfür können die Größenbereiche entsprechend definiert werden.

Fallbeispiel

Tabelle 1: Anzahl von Mikroplastik identifiziert mittels Ramanmikroskopie auf 50µm-Filter in einer Wasserprobe aus der Warnow.
Tabelle 1: Anzahl von Mikroplastik identifiziert mittels Ramanmikroskopie auf 50µm-Filter in einer Wasserprobe aus der Warnow.
(Bild: Leibniz-Institut für Polymerforschung Dresden (ipf))

Eine vom Leibniz-Institut für Ostseeforschung Warnemünde aufgenommene und aufgearbeitete Wasserprobe (308,5 Liter) aus der Warnow, die in die Ostsee fließt, wurde auf zwei Siliziumfilter filtriert. Auf dem ersten Filter befinden sich 11.000 Partikel und auf dem zweiten Filter 1.300 Partikel (s. Abb. 1). Die Ergebnisse der Identifizierung aller Partikel sind in Tabelle 1 (s. online auf www.laborpraxis.de) dargestellt. Wie man darin sieht, handelt es sich bei nur einem kleinen Anteil von 3 Prozent der Gesamtpartikel tatsächlich um Mikroplastik. Die meisten identifizierten Partikel bestehen aus Zellulose oder β-Karotin und sind wahrscheinlich pflanzlichen Ursprungs. Das am häufigsten in dieser Probe identifizierte Polymer ist Polypropylen. Deutlich weniger werden weitere Polymere, wie Polyethylen, Polystyren und Polyethylenterephthalat gefunden. Mit der Raman-Spektroskopie können neben Polymeren auch Farbstoffe identifiziert werden, die in der Tabelle mit erfasst sind.

Abb. 3: Ergebnisse der Analyse: Die Mikroplastikpartikel werden als ein Falschfarbenoverlay auf dem Übersichtsfenster dargestellt, während im Analysefenster die Größenverteilung der Partikel für ausgewählte Materialklassen sowie das Spektrum des aktiven Partikels gezeigt wird.
Abb. 3: Ergebnisse der Analyse: Die Mikroplastikpartikel werden als ein Falschfarbenoverlay auf dem Übersichtsfenster dargestellt, während im Analysefenster die Größenverteilung der Partikel für ausgewählte Materialklassen sowie das Spektrum des aktiven Partikels gezeigt wird.
(Bild: Leibniz-Institut für Polymerforschung Dresden (ipf))

Laufende Weiterentwicklung

Gepard wird immer weiter an die wachsenden Anforderungen einer hochautomatisierten Auswertung in der Mikroplastikanalytik angepasst und ist aktuell, auch dank der Unterstützung der Mikroskophersteller, mit den spektroskopischen Mikroskopen von Witec, Renishaw und Perkinelmer und dem optischen Mikroskop von Zeiss kompatibel (s. auch LP-Info-Kasten) . n

Quellen

[1] https://www.uni-bayreuth.de/en/university/press/press-releases/2021/089-microplastics-food/index.html

[2] https://www.efsa.europa.eu/en/events/event/update-scientific-colloquium-25-coordinated-approach-assess-human-health

[3] Enders K, Lenz R, Ivar do Sul JA, Tagg AS, Labrenz M. When every particle matters: A QuEChERS approach to extract microplastics from environmental samples. MethodsX. 2020 Jan 15;7:100784. doi: 10.1016/j.mex.2020.100784

[4] Brandt J, Bittrich L, Fischer F, Kanaki E, Tagg A, Lenz R, Labrenz M, Brandes E, Fischer D, Eichhorn KJ. High-Throughput Analyses of Microplastic Samples Using Fourier Transform Infrared and Raman Spectrometry. Appl Spectrosc. 2020 Sep;74(9):1185-1197. Doi: 10.1177/0003702820932926

[5] https://gitlab.ipfdd.de/GEPARD/gepard/

[6] https://www.ipfdd.de/spectroscopy-and-microplastics

[7] http://www.gnu.org/licenses/lgpl-3.0.de.html

* Dr. E. Kanaki, Dr. F. Fischer, Dr. D. Fischer: Leibniz-Institut für Polymerforschung Dresden, 01069 Dresden, E-Mail: kanaki@ipfdd.de

* *Dr. J. Brandt: University of Gothenburg, Department of Marine Sciences, SE - 451 78 Fiskebäckskil, Schweden

* **R. Ohmacht: Freiberuflicher Software-Entwickler, 01069 Dresden

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