WIRKSTOFFFORSCHUNG Schnelle Immundiagnostik mit Bio-Chips

Eine sichere Diagnose zu erstellen benötigt oft, besonders bei nicht eindeutigen Krankeitsbildern, mehrere diagnostische Tests und wertvolle Zeit, bevor mit einer gezielten Therapie begonnen werden kann.

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Eine sichere Diagnose zu erstellen benötigt oft, besonders bei nicht eindeutigen Krankheitsbildern, mehrere diagnostische Tests und wertvolle Zeit, bevor mit einer gezielte Therapie begonnen werden kann.

Der Zeitbedarf für die Diagnostik wird in der klinischen Mikrobiologie zunehmend bedeutsamer. Eine schnelle Diagnostik bietet neben den Vorteilen für den Patienten auch verkürzte Behandlungszeiten und damit verbunden Kosteneinsparungen. Ein neues, kompaktes Diagnosesystem, bestehend aus Einweg-Bio-Chips, einem Assay-Prozessor sowie einem Fluoreszenz-Reader, wird gegenwärtig vom Fraunhofer-Institut für Mikrointegration und Zuverlässigkeit IZM in München und der Mikrogen GmbH in Neuried in Zusammenarbeit mit Kunststofftechnik Scherer&Trier und der Universität Regensburg entwickelt.

Es ermöglicht automatisch den parallelen Nachweis von Patientenantikörpern gegen bis zu 100 verschiedene Erreger-Antigene. Bereits nach etwa zwei Stunden kann dann der Arzt wissen, ob z.B. eine Arthritis eine infektiöse Ursache hat und, wenn ja, welcher Erreger dafür verantwortlich ist, und mit der optimalen Therapie beginnen.

Multiparameter-Diagnosesystem

Infektionskrankheiten stellen einen der größten Kostenfaktoren im Gesundheitswesen Deutschlands dar. Aus Kostengründen, aber auch wegen der begrenzten Menge an Untersuchungsmaterial sind rasche Diagnostik-Methoden auf breiter Basis, die mit geringstem Probenmaterial auskommen, dringend notwendig. Daraus ergibt sich die Forderung der gleichzeitigen Bestimmung mehrerer Messparameter für eine Vielzahl möglicher Krankheitserreger in einem einzigen Testansatz.

Die moderne Serologie steht außerdem vor der Herausforderung, auch für komplexe Krankheitsbilder eine schnelle und umfassende Diagnostik bei moderaten Kosten zu gewährleisten. Allerdings erfolgt die serologische Differenzialdiagnostik von unklaren Krankheitsbildern oder Krankheitsbildern mit mehreren in Frage kommenden Erregern gegenwärtig meist noch mit Einzelparametertests, die parallel oder auch nacheinander durchgeführt werden. Multiparametertests, mit deren Hilfe eine einzelne Patientenprobe auf eine Vielzahl verschiedener Parameter hin untersucht werden kann, gelten daher als wichtiges Werkzeug zukünftiger Diagnostik.

Vom Fraunhofer-Institut für Mikrointegration und Zuverlässigkeit IZM in München und der Mikrogen GmbH in Neuried wurde ein leistungsfähiges und kostengünstiges Diagnosesystem für hochparallelisierte Immuntests auf der Basis von Einmal-Bio-Chips in Kunststofftechnik bis zum Prototyp entwickelt.

Das System ist als einheitliche Bio-Chip-Plattform ausgelegt, auf der unter Verwendung von serologisch relevanten einzelantigenen Tests für verschiedene Krankheitskomplexe in einer Serumprobe entwickelt wurden. Es erlaubt die Bestimmung der humanen IgG- und IgM- bzw. IgA-Antwort gegen bis zu 100 rekombinant hergestellte Proteine und sonstige Antigene. Vergleichbare Aussagen können zurzeit nur mit wesentlich aufwändigeren und teureren Testsystemen wie etwa im Western-Blot- oder Line-Assay erreicht werden, allerdings bei erheblich eingeschränkter Komplexität.

Mit dem neu entwickelten Multiplex-Assay im Bio-Chip-Format kann in der Regel der aktuelle Status einer Infektionserkrankung eines Patienten erkannt und gezielt therapiert werden, da je nach Krankheitsstadium verschiedene Antigene des Erregers exprimiert werden und als Folge entsprechende Antikörper im Blut gebildet werden. Da die humanen Antikörper gegen verschiedene Antigene der Erreger parallel in einem Test untersucht werden, können zeit- und kostenraubende sequenzielle Laboruntersuchungen vermieden werden.

Die derzeit üblichen Wartezeiten von einigen Tagen für Laborbefunde könnten sich durch den Einsatz des Bio-Chip-Systems auf wenige Stunden reduzieren, da die Untersuchungen nicht mehr in einem zentralen Labor erfolgen müssten, sondern direkt vor Ort auch in kleineren Kliniken oder großen Arztpraxen durchführbar wären. Die Bio-Chip-Plattform wurde daher als Stand-alone-Tischgerät realisiert, um die Tests unabhängig von einem medizinischen Laboratorium vollautomatisch auch in der Arztpraxis durchzuführen. Eine schnelle, effiziente und kostensparende Reaktion des Arztes wird damit möglich.

Die Systemkomponenten

Das Diagnosesystem lässt sich durch drei wesentliche funktionelle Einheiten definieren: immunologischer Test, Bio-Chip-Kartusche und Analysegerät. Die Bio-Chip-Kartusche besteht aus einer Kartusche mit entsprechender Mikrofluidführung für den Ablauf des immunologischen Tests sowie dem eigentlichen Bio-Chip, der die biologisch reaktiven Antigene beinhaltet. Das Analysegerät wiederum gliedert sich in einen Assayprozessor, der den Reaktionsablauf vollautomatisch steuert, und einen Fluoreszenz-Reader, in dem die Immunreaktionen fluoreszenzspektrometrisch ausgewertet werden. Eine entsprechende Software steuert beide Geräte und wertet die Messergebnisse aus.

Bio-Chip-Kartusche

Die Bio-Chip-Kartusche ist ein vollständiges scheckkartengroßes Minilabor, in dem bis zu 100 verschiedene Immuntests parallel durchgeführt werden können. Dabei laufen alle Analyseschritte der Serumprobe in der Kartusche ab. Diese Kartusche bildet ein abgeschlossenes System mit den Komponenten: Kartuschenkörper mit Serumbehälter und Mikrofluidkanälen, Kunststoffchip mit immobilisierten Antigenen, Deckfolie zum Versiegeln der Kartusche und elastisches Septum für die fluidische Ankopplung an den Assayprozessor (s. Abb.1).

Die Antigene werden durch ein kontaktloses Dispensierverfahren auf einen etwa 1 cm2 großen Plastikchip aufgebracht. Die Mikrokanäle in der Kartusche ermöglichen mithilfe des Assayprozessors den unten beschriebenen Reaktionsablauf. Nach Beendigung der Immunreaktion wird die Kartusche zur Auswertung in die Fluoreszenz-Messstation überführt.

Analysegerät

Der Prototyp besteht aus zwei Tischgeräten, einem Assayprozessor, in dem der Immunoassay in der Bio-Chip-Kartusche durchgeführt wird, und einem Fluoreszenz-Reader, in dem der Assay ausgewertet wird.

Im ersten Schritt wird der Serumbehälter der Kartusche mit verdünntem Serum befüllt und in den Assayprozessor eingesetzt und das Serum gleichmäßig über das Dot-Array gesaugt. Nach der Seruminkubation erfolgt die Reaktion gebundener Antikörper mit Fluoreszenzfarbstoffkonjugaten. Sowohl im Anschluss an die Serum- als auch an die Konjugatinkubation sorgt ein Spülzyklus für die zuverlässige Entfernung der nicht gebundenen Serum- bzw. Konjugatreste. Die fertigen Tests liegen nach etwa zwei Stunden vor.

Im Assayprozessor (s. Abb.2) können, je nach ausgewählter Software, vollautomatisch ein bis fünf Kartuschen parallel bearbeitet werden. Da die biologische Reaktion deutlich länger dauert als das optische Auslesen, lässt sich durch diese parallele Bearbeitung ein effizienter Ablauf und guter Durchsatz erreichen.

Alle erforderlichen Reagenzlösungen wie Puffer, Fluoreszenzfarbstoffkonjugate und Konditioniermedien werden vom Assayprozessor vollautomatisch mittels eines Systems aus Pumpen, Verteilern und Ventilen computergesteuert in die Bio-Chip-Kartusche gepumpt. Das Serum wird nicht ins Gerät, sondern direkt in die Kartusche pipettiert. Dadurch wird eine Kontamination des Assayprozessors und nachfolgender Kartuschen mit Fremdseren verhindert. Durch die Einlass-Ports der Kartusche kommen nur frische Medien aus dem Assayprozessor. Die Auslass-Ports kommen mit Serum und verbrauchten Reagenzien in Berührung, aber durch Separationsmedien wird eine Rückdiffusion in nachfolgende Kartuschen verhindert.

Die Analyse der Immunreaktionen erfolgt im Reader durch Detektion der Fluoreszenzfarbstoffkonjugate. Das entwickelte Gerät basiert auf einer lokalen und somit ortsaufgelösten Anregung durch ein LED-Array mit 100 superhellen Leuchtdioden und einem über die gesamte Bio-Chip-Fläche integrierenden ringförmigen Lichtsammler. Das Fluoreszenzlicht wird durch hochselektive Interferenzfilter vom Anregungslicht getrennt und mit einem Photomultiplier detektiert.

Durch die Verwendung von Farbstoffkonjugaten mit unterschiedlichen Immunglobulinen (z.B. Anti-human-IgG und Anti-human-IgM) können die beiden Antikörperklassen IgG und IgM, die in unterschiedlichen Stadien der Infektion in unterschiedlichen Mengen vorliegen, quantitativ nachgewiesen werden. Durch Referenz-Dots auf dem Bio-Chip ist eine quantitative Auswertung möglich. Abbildung 3 zeigt den prinzipiellen Aufbau des Detektionssystems. Das Auslesen des Assays erfolgt innerhalb von zwei Minuten. Die Nachweisgrenze liegt unterhalb von 1 fmol Fluoreszenzfarbstoff je Dot.

Testergebnisse

Als Prototyp des Diagnosesystems wurde ein Assay zur Diagnostik der reaktiven bzw. infektassoziierten Arthritis entwickelt. Das Krankheitsbild der reaktiven bzw. infektassoziierten Arthritis kann durch eine Vielzahl verschiedener bakterieller oder auch viraler Erreger verursacht werden. In vielen Fällen ist die Arthritis jedoch auch auf Autoimmunerkrankungen oder einfachen Gelenkverschleiß zurückzuführen. Das Diagnosesystem ermöglicht somit die Identifizierung bzw. den Ausschluss einer infektiösen Ursache der Arthritis. Im Falle einer infektiösen Ursache wird gleichzeitig der verantwortliche Erreger identifiziert.

Im Prototyp werden humane Antikörper gegen 39 rekombinante Antigene von zehn verschiedenen bakteriellen und viralen Krankheitserregern bzw. von humanen Autoimmunantigenen nachgewiesen. Das Panel enthält rekombinante Antigene der Bakterien Yersinia enterocolitica, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Campylobacter jejuni, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Borrelia burgdorferi, Streptococcus pyogenes, der Viren Parvovirus B19 und Epstein-Barr-Virus (EBV) sowie ausgewählte humane Autoimmunantigene. Alle Erreger mit Ausnahme von EBV kommen als Erreger einer reaktiven bzw. infektassoziierten Arthritis in Frage. Um eine unspezifische polyklonale Antikörperstimulation, wie sie durch eine akute EBV-Infektion ausgelöst wird, zu erkennen, wird zusätzlich der EBV-Immunstatus bestimmt.

In Abbildung 4 sind Beispiele des mit dem Diagnosesystem bestimmten IgG-Antikörperstatus von je fünf Patienten mit reaktiver bzw. infektassoziierter Arthritis sowie fünf gesunden Blutspendern dargestellt (Abb. 5). Alle Arthritis-Patienten ebenso wie die gesunden Blutspender verfügen über IgG-Antikörper gegen EBNA-1 und VCA-p18, die ausschließlich bei zurückliegenden EBV-Infektionen anzutreffen sind, so dass bei allen Arthritis-Patienten und Blutspendern eine infektiöse Mononukleose mit polyklonaler B-Zell-Stimulation ausgeschlossen werden kann. Weitere Erreger mit einer hohen Prävalenz sind Chlamydia pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Yersinia enterocolitica und Parvovirus B19.

Geringe IgG-Antikörpermengen gegen Antigene dieser Erreger sind daher auch bei den gesunden Blutspendern häufig zu finden. Entsprechende geringe IgG-Antikörpermengen gegen diese Antigene bei Arthritis-Patienten sind daher kein hinreichendes Kriterium zum Nachweis einer durch diesen Erreger ausgelösten reaktiven bzw. infektassoziierten Arthritis.

Im Gegensatz zu den Blutspendern sind bei den Arthritis-Patienten wesentlich höhere IgG-Antikörpermengen gegen die einzelnen Erreger zu finden. Bei den fünf Arthritis-Patienten sind jeweils hohe Antikörpertiter gegen Antigene eines speziellen Erregers vorhanden, so bei Patient 14 gegen Parvovirus B19. Die Analyse der Reaktivitäten gegen die einzelnen rekombinanten Antigene erlaubt bereits in vielen Fällen eine weitergehende Diagnostik. So sind z.B. Antikörper gegen Parvovirus B19 VP-C in der Regel nur in den ersten sechs Monaten nach der Infektion mit dem Virus nachweisbar - genau die Phase, innerhalb derer sich eine infektassoziierte Arthritis ausbildet.

Ausblick

Das Diagnosesystem für humane Antikörper liegt gegenwärtig als Prototyp vor. Die Entwicklung wurde von der Bayerischen Forschungsstiftung gefördert. Das System ist so offen konzipiert, dass auch andere Protein-Protein-Wechselwirkungen damit grundsätzlich messbar sind. Vorrangiges Ziel ist es, das System schnellstmöglich zur Serienreife zu bringen und in klinischen Studien zu evaluieren.

*Frauenhofer-Institut für Mikrointegration und Zuverlässigkeit IZM, München **Mikrogen GmbH, Neuried ***Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Uni Regensburg

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