Zusammensetzung des Eulenten So beeinflussen Sie die Elutionsreihenfolge in der HPLC

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Die Zusammensetzung der Eluenten ist in der Reversed-Phase-HPLC ein entscheidender Faktor für die Optimierung. Hierbei kann auch die Zugabe von Säure zum Eluenten ein geeignetes Mittel sein. Am Beispiel von Ibuprofen und Valerophenon wird dies gezeigt.

Die Selektivität, also der Unterschied in der chromatographischen Retention zwischen zwei Analyten, ist der wichtigste Optimierungsparameter in der HPLC. Beeinflusst werden kann sie grundsätzlich durch Veränderung der stationären Phase, des Eluenten und manchmal auch der Temperatur. Wenngleich es viele hilfreiche Anhaltspunkte zur geschickten Wahl von Säulen und mobilen Phasen gibt, ist eine systematische Selektivitätsoptimierung hier grundsätzlich anspruchsvoll. In diesem Beitrag soll die Bedeutung der Eluentenzusammensetzung in der Reversed-Phase-(RP)-HPLC kurz beleuchtet und ein Konzept zur systematischen Optimierung vorgestellt werden.

In der vorangegangenen Folge dieser Artikelserie wurde die systematische Selektivitätsoptimierung mittels Temperaturänderung vorgestellt. Diese kann sehr effektiv mittels einer Auftragung gemäß der van’t Hoff’schen Gleichung

erfolgen, die einen linearen Zusammenhang zwischen dem Logarithmus des Kapazitätsfaktors k und der reziproken absoluten Temperatur beschreibt.

In der RP-Chromatographie gibt es grundsätzlich auch einen linearen Zusammenhang zwischen dem Logarithmus des Kapazitätsfaktors k und der Elutionsstärke der mobilen Phase. Dieser ist relativ einfach und wird in Gleichung 2 beschrieben:

Ähnlich wie bei der van’t Hoff’schen Gleichung ist die strenge Linearität nur dann gegeben, wenn der Retentionsmechanismus über den gesamten Bereich der Zusammensetzung an organischer Komponente in der mobilen Phase konstant bleibt. Dies ist wegen der üblicherweise eher gemischten Retentionsmechanismen in der RP-HPLC oft nur in eingeschränkten Bereichen der Fall. Dennoch hilft dieser Zusammenhang bei der praktischen Optimierung der Selektivität. Dies soll nun an einem Beispiel aus der pharmazeutischen Analytik demonstriert werden.

Trennung von Ibuprofen und Valerophenon

Die Trennung von Ibuprofen und Valerophenon mit einer Mindestauflösung von 2,0 ist durch die United States Pharmacopeia (USP) klar geregelt. Während der Wirkstoff Ibuprofen eine schwache Säure ist, handelt es sich bei der Verbindung Valerophenon (Interner Standard) um eine Neutralsubstanz. Dieser wesentliche Unterschied in den Moleküleigenschaften gibt Anlass zur Annahme, dass auch die Retentionsmechanismen zwischen den beiden Komponenten in der RP-HPLC abweichen könnten.

Letzteres ist eine Voraussetzung für unterschiedliche Steigungen b in Gleichung 2 für verschiedene Analytsubstanzen. Substanzen, die sich in ihrer Struktur nicht durch verschiedene funktionale Gruppen unterscheiden, zeigen normalerweise eine sehr ähnliche Steigung und die Selektivität ändert sich nicht mit der Eluentenstärke.

Die Reihe der Chromatogramme in Abbildung 2a zeigt jedoch deutlich, dass im vorliegenden Fall Ibuprofen bei Acetonitril-Gehalten unterhalb von 40 % auf der verwendeten Säule (und bei 0,1 % Gehalt an Phosphorsäure in der mobilen Phase) nach Valerophenon eluiert, während bereits bei 40 % sich die Elutionsreihenfolge umgekehrt hat. Bei dieser Eluentenzusammensetzung ist die Auflösung der beiden Komponenten mit 1,29 klar unzureichend, aber eine weitere Erhöhung des Acetonitril-Gehaltes steigert die (nun umgekehrte Selektivität) und verbessert auch die Auflösung dramatisch. Der damit verbundene Nutzen für den Anwender ist eine deutliche Verkürzung der Analysenzeit, gegenüber der Methode mit Elution des Ibuprofens nach Valerophenon.

Wie aus Tabelle 1 zu ersehen, ist bei einem Acetonitril-Gehalt von 50 % auch die in der United States Pharmacopeia (USP) geforderte Mindestbodenzahl von 8000 sehr gut erfüllt, mit einem Retentionsfaktor von 3,2 ausreichend Retention für Ibuprofen vorhanden, während die Peaksymmetrie für beide Komponenten ähnlich bleibt. Im Anschluss sollen nun die Retentionsfaktoren beider Komponenten gemäß Gleichung 2 aufgetragen werden. Abbildung 3a zeigt klar, dass für beide Komponenten keine perfekte Linearität über den gesamten Bereich festgestellt werden kann.

Für die Neutralsubstanz Valerophenon sind die Abweichungen von der Linearität eher marginal, für die Säure Ibuprofen sind sie deutlicher ausgeprägt.

In der Tat lassen sich für Ibuprofen zwei Bereiche mit unterschiedlicher Steigung identifizieren (in Abbildung 3a eingezeichnet). Dennoch lässt sich auch aus der linearen Regression über alle sechs Messpunkte sofort der Schluss ziehen, dass bei Acetonitril-Gehalten oberhalb von 40 % Ibuprofen vor Valerophenon eluiert. Diese Erkenntnis wäre auch mit weniger Messpunkten möglich gewesen.

Die Darstellung in Abbildung 3 zeigt deutlich, dass eine Auftragung gemäß Gleichung 2 sehr hilfreich ist, um bei der Methodenentwicklung auch im Falle einer Elutionsumkehr einen sinnvollen Gehalt an organischer Komponente zu ermitteln. Dieser kann auf beiden Seiten des Schnittpunktes liegen, wobei dies einen deutlichen Einfluss auf die Analysengeschwindigkeit haben wird.

Phosphorsäure-Zusatz in der mobilen Phase

Der Zusatz von Säure zur mobilen Phase unterdrückt sowohl die Dissoziation schwach saurer Analyte (z.B. Ibuprofen), als auch die Dissoziation saurer Restsilanolgruppen der Kieselgel-basierten Umkehrphase. Beides hat normalerweise Einfluss sowohl auf Retention und Selektivität, als auch auf die Peakform. Alternativ wurde eine Messreihe mit verschiedenen Acetonitril-Gehalten, jedoch ohne Zusatz von Phosphorsäure aufgenommen, deren Chromatogramme in Abbildung 2b dargestellt sind. Es lässt sich sowohl der Einfluss auf Retention und Selektivität, als auch der dramatische Einfluss auf die Peakform von Ibuprofen bei geringem Gehalt an Acetonitril erkennen. Das starke Peak-Fronting von Ibuprofen reduziert sich jedoch mit steigenden Acetonitril-Gehalt und ist nach der Elutionsumkehr komplett verschwunden (s. Tab. 1). Die theoretische Erklärung ist, dass auch das stärker organische (hier sogar aprotische) Milieu die Dissoziation des Ibuprofens und der Silanolgruppen unterdrückt. Auch die Anwendbarkeit von Gleichung 2 und der entsprechenden Optimierungsstrategie in Abwesenheit von Phosphorsäure geht aus Abb. 3b deutlich hervor. Mit der Phosphorsäure-freien Methode steht bei einem Acetonitril-Gehalt von 50 % eine Alternativmethode zur Verfügung.

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* Dr. F. Steiner, S. Große: Thermo Fisher Scientific, 82210 Germering

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