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Gensonden Sondenbasierte Detektion einer siRNA-vermittelten Genmodulation

| Autor / Redakteur: Don Weldon und Grace Johnston* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Um Genfunktionen zu erforschen, schalten Wissenschaftler oft gezielt bestimmte Gene aus. Um die Effizienz dieser Stilllegung zu überprüfen, bedarf es spezieller Detektionsverfahren. Idealerweise sind diese nicht nur genau, sondern lassen die untersuchten Zellen sogar intakt.

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Abb. 1: Eine Smartflare-Sonde besteht aus einem Gold-Nanopartikel, an den ein ca. 40 Nukleotide langer DNA-Strang gekoppelt ist, der komplementär zu einem Teil der Ziel-RNA-Sequenz ist.
Abb. 1: Eine Smartflare-Sonde besteht aus einem Gold-Nanopartikel, an den ein ca. 40 Nukleotide langer DNA-Strang gekoppelt ist, der komplementär zu einem Teil der Ziel-RNA-Sequenz ist.
(Bild: Merck Millipore)

Die Modulation der Genexpression unter Verwendung von Techniken wie der RNA-Interferenz ist zu einem fundamentalen Werkzeug der Erforschung von Genfunktion und biologischen Reaktionswegen geworden [1]. Für die Ermittlung der Effizienz der Stilllegung von Genen (Gen-Knockdown) mittels gängiger Detektionsmethoden müssen Zellproben durch Lyse oder Permeabilisierung und Fixierung zerstört werden. Ein weiterer Nachteil dieser Techniken besteht darin, dass die erhaltenen Ergebnisse nur die durchschnittliche Genexpression der gewonnenen Zellpopulation widerspiegeln. Eine nicht destruktive Option ist die Verwendung von transfizierten Reporterkonstrukten. Obwohl die Zellen dabei am Leben bleiben, lässt sich damit jedoch nicht die endogene Genexpression nachweisen. Zudem kommt es zu negativen Auswirkungen auf die Zellgesundheit.

Ein idealer RNA-Detektionsagent ermöglicht nicht nur einen nicht invasiven Zugang zur Erforschung der Genexpression, sondern auch die Sortierung lebender Zellen, die in der Folge isoliert und direkt für nachfolgende Analysen verwendet werden können.

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Die Smartflare-RNA-Detektionssonden (EMD Millipore, Billerica/ USA) sind in der Lage, Ziel-RNA- und micro-RNA-Spiegel in lebenden, intakten Zellen zu detektieren. Die Sonden benötigen keinen Träger, um in die Zellen einzudringen, und haben keinerlei toxische Wirkung auf die Zellgesundheit [2]. Sie ermöglichen dem Anwender eine rasche Verifizierung der Genexpresssion sowie, in Verbindung mit der Sortierung der Zelltypen, eine Isolierung der gewünschten Zellpopulationen. Zudem erfordern diese Reagenzien keine Probenaufbereitung, und nach dem Detektionsvorgang hinterlassen sie intakte Zellen, die für weitere, nachfolgende Analysen verwendet werden können.

Mit diesem Ansatz konnte gezeigt werden, wie sich unter Verwendung einer für die interessierende Ziel-RNA spezifischen Sonde eine genaue und effiziente Detektion des siRNA-vermittelten Gen-Knockdown erzielen lässt. Die Sonden ermöglichen eine rasche und genaue Detektion der Zielgenexpression in einer einzelnen Zelle.

Die Fähigkeit der spezifischen Detektion von RNA-Spiegeln auf Einzelzellbasis bietet neue Möglichkeiten, einen Zusammenhang zwischen biologischen Pfaden und physiologischen Prozessen auf der einen Seite und Genfunktionen auf der anderen Seite herzustellen.

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