Sondenbasierte Detektion einer siRNA-vermittelten Genmodulation

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Knockdown und Detektion – Material und Methoden

Das im Rahmen dieser Studie durchgeführte mRNA-Knockdown, die mRNA-Detektion per Durchflusszytometrie sowie vergleichend per qRT-PCR wurde wie folgt durchgeführt:

• mRNA-Knockdown: SCC12-Zellen (Zelllinie des humanen Plattenepithelkarzinoms) sowie LNCaP-Zellen (humanes Prostatakarzinom) wurden in 96-Well-Mikrotiterplatten zu 10 000 Zellen/Well ausgesät. 24 Stunden nach der Aussaat wurden die Zellen vorübergehend mit der Kontrolle oder mit Survivin-spezifischer siRNA transfiziert und 48 Stunden lang inkubiert. Survivin ist ein Apoptose-Inhibitor-Protein, das in vielen Krebszelllinien in hohem Maße hochreguliert wird [3]. Nach der Inkubationszeit wurde das Medium gewechselt, um siRNA und Transfektionsagent zu entfernen.

• Modulationsdetektion: Nach der siRNA-Behandlung wurden die SCC12- und LNCaP-Zellen mit einer 1000-fachen Verdünnung der Survivin-spezifischen Smartflare-Sonde oder der Smartflare-Kontrollsonde in einem Zellwachstumsmedium über Nacht inkubiert. Am nächsten Morgen wurden die Zellen trypsinisiert und mit dem Durchflusszytometer Guava Easycyte 8HT analysiert. Gleichzeitig wurden die nicht zur Weiteruntersuchung mit den Smartflare-Sonden bestimmten siRNA-behandelten Zellen geerntet und für vergleichende Analysen mittels quantitativer Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) herangezogen.

• qRT-PCR: Die Gesamt-RNA wurde mit dem RNeasy Kit (Qiagen) extrahiert und dem Taqman RNA-to-Ct 1-Step Kit (Life Technologies) hinzugegeben. Die qRT-PCR wurde mit einem Lightcycler-480-System (Roche) durchgeführt (s. Abb. 2).

Ergebnisse der mRNA-Detektionsanalysen

Die durchgeführten Analysen ergaben folgende Ergebnisse:

• mRNA-Detektion mittels Durchflusszytometrie: Für die Detektion des Gen-Knockdown wurden Survivin-spezifische Sonden mit SCC12- und LNCaP-Zellen, die mit Survivin und Kontroll-siRNA behandelt worden waren, inkubiert. Unterschiede in den Expressionsniveaus des Zielgens ließen sich durch Analyse der mit zielspezifischen Sonden behandelten Zellen mittels Durchflusszytometrie nachweisen (s. Abb. 3).

• mRNA-Detektion mittels qRT-PCR: Für die Detektion des Gen-Knockdown mittels qRT-PCR wurden Survivin-spezifische Smartflare-Sonden und Kontrollsonden mit SCC12- und LNCaP-Zellen, die mit Survivin und Kontroll-siRNA behandelt worden waren, inkubiert. Die mithilfe der Smartflare-Technologie ermittelten relativen Genexpressionsniveaus wurden in Form von Säulendiagrammen grafisch dargestellt und mit den qRT-PCR-Daten verglichen. Dieser Vergleich zeigte, dass die relativen Genexpressionspiegel qualitativ ähnlich waren, und zwar ungeachtet der für die Messung des Knockdown verwendeten Technologie (s. Abb. 4 und online).

Da die Smartflare-Technologie die Analyse der Genexpression in einzelnen, intakten Zellen ermöglicht, konnten noch zusätzliche Informationen über die Populationsverteilung der verschiedenen behandelten Zellen erhalten werden. Insbesondere wurde beobachtet, dass die mit der Survivin-spezifischen Smartflare-Sonde behandelten LNCaP-Zellen eine unimodale Verteilung des Überlebenssignals zeigten, während bei den SCC12-Zellen eine bimodale Verteilung vorlag.

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