Sondenbasierte Detektion einer siRNA-vermittelten Genmodulation

LP: Frau Dr. Tritsch, wie sind ihre neuen RNA-Detektionssonden aufgebaut und wie werden sie eingesetzt?

Dr. Eva Tritsch: Smartflare-RNA-Detektionssonden werden in Wasser rekonstituiert, zum Zellkulturmedium gegeben und über Nacht mit den Zellen inkubiert. Dabei gelangen die Sonden über den natürlichen Aufnahmemechanismus Endozytose in die Zelle. Eine Smartflare-Sonde besteht aus einem Gold-Nanopartikel, an den der „Capture Strand“ gekoppelt ist. Dieser DNA-Strang ist ca. 40 Nukleotide lang und komplementär zu einem Teil der Ziel-RNA-Sequenz. An den Capture Strand ist komplementär der „Reporter Strand“ gelagert. Dieser Strang trägt somit einen Teil der Ziel-RNA-Sequenz. An den Reporter-Strand ist ein Fluorophor (Cy3 oder Cy5) gekoppelt, welches am nahen Ende zum Goldpartikel liegt.

LP: Und wie erfolgt damit die spezifische Detektion von RNA-Spiegeln auf Einzelzellbasis?

Tritsch: Aufgrund der Nähe des Fluorophores zum Gold und den Eigenschaften von Gold als Fluoreszenzinhibitor wird in diesem Grundzustand der Sonde kein Fluoreszenzsignal emittiert. Bei Vorhandensein der Ziel-RNA im Zytosol wird diese durch Sequenzkomplementarität an den Capture Strand binden und den Reporter Strand verdrängen, da die Affinität der endogenen Ziel-RNA höher als die des Reporters ist. Es handelt sich hierbei somit um eine Kompetitionsreaktion. Infolgedessen verlässt der Reporter Strand den Goldpartikel und die Fluoreszenz ist nicht mehr inhibiert. Es entsteht somit ein Fluoreszenzsignal im Zytosol, welches detektiert werden kann.

LP: Welche neuen Möglichkeiten ergeben sich daraus genau?

Tritsch: Smartflare-Sonden erlauben die Analyse von RNA in einzelnen lebenden Zellen, ohne diese zu schädigen oder die Genexpression signifikant zu beeinflussen. Die Zellen bleiben vital und können für weitere Analysen kultiviert und expandiert (passagiert) werden. Der Forscher erhält einen Fluoreszenzwert der detektierten Ziel-RNA für jede einzelne Zelle (statt einem Mittelwert der Gesamtpopulation), was die Charakterisierung der Zellpopulation erlaubt. Subpopulationen der Probe können so im FACS-Gerät sortiert werden.

LP: Wodurch wird gewährleistet, dass die Zellen durch diesen Prozess nicht zerstört oder geschädigt werden?

Tritsch: Gold-Nanopartikel benötigen kein Transfektionsreagenz, um in die Zelle zu gelangen und wirken nicht toxisch auf die Zellen. Sie gelangen per Endozytose in die Zelle – derren nativer Zustand bleibt somit erhalten. Unsere F&E hat in Viabilitätsstudien belegt, dass diese für Zellen mit und ohne Zugabe der Smartflare-Sonden gleich bleibt.

LP: Ihre neuen Detektionssonden benötigen keine Probenvorbereitung. Worauf muss der Anwender beim Einsatz achten?

Tritsch: Die Proben kommen als Lyophilisat beim Anwender an und sind in dieser Form für fünf Jahre bei 4°C haltbar. Nach Rekonstituierung in 50 µl Wasser sollten die Sonden lichtgeschützt und ausschließlich bei Raumtemperatur (ungekühlt) aufbewahrt werden.