Strukturaufklärung unbekannter Abbauprodukte in Arzneimitteln

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Welche analytischen Methoden sind geeignet?

Unter einer gekoppelten Methode versteht man prinzipiell ein zweidimensionales Analysenverfahren, d.h. die in der Chromatographie detektierten Signale (1. Dimension) werden mit der nachgeschalteten z.B. massenspektrometrischen Methode (2. Dimension) identifiziert. Als gekoppelte Analysentechniken kommen dabei in den meisten Fällen HPLC-UV-MS- oder GC-MS-Methoden zum Einsatz. Die HPLC-NMR-Kopplung ist in einigen Fällen hilfreich, jedoch nicht bei geringen Verunreinigungskonzentrationen.

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• Die GC-MS-Kopplung kann bei der Strukturaufklärung von flüchtigen (verdampfbaren) Verunreinigungen eingesetzt werden (z.B. Restlösungsmittel, Restmonomere etc.). Schwerflüchtige Verunreinigungen werden dagegen besser mit HPLC-MS-Kopplung analysiert. Der Vorteil der GC-MS-Kopplung besteht darin, dass die Spektren unter standardisierten Bedingungen aufgenommen werden und deshalb geräteunabhängig vergleichbar sind. Mithilfe von käuflich erhältlichen Spektrenbibliotheken lassen sich somit im Idealfall rasch Hinweise auf die chemische Struktur der flüchtigen Verunreinigung finden.

• Die HPLC-MS-Kopplung wird bei der Identifizierung von Verunreinigungen am häufigsten eingesetzt. Meistens wird die so genannte HPLC-UV-MS-Kopplung mit einer zwischengeschalteten UV-Detektion verwendet. Dies ermöglicht die direkte Korrelation zwischen den im HPLC-UV-Chromatogramm gefundenen Verunreinigungen und dem Massenspektrum. Mit so genannten QToF-Massenspektrometern (Quadrupol-Time-of-Flight-Massenspektrometer) lässt sich die Molmasse der Verunreinigung genau bestimmen (weniger als 1 ppm Abweichung). Damit kann die exakte Summenformel der Verunreinigungskomponente ermittelt werden. Mithilfe der MSMS-Technik werden die massenspektrometrischen Bruchstücke in weitere kleinere Bruchstücke zerlegt (sog. Tochterionen). Durch geschickte Kombination der Information über die Tochterionen und die Molmasse lässt sich die Struktur der Verunreinigung rekonstruieren. Im Unterschied zur GC-MS-Kopplung gibt es bei der HPLC-MS-Kopplung kaum käuflich erhältlichen Spektrenbibliotheken, da die Spektren zu sehr geräteabhängig und nicht standardisierbar sind. Die HPLC-MS-Kopplung kann nur mit verdampfbaren Lösungsmitteln (z.B. Methanol, Acetonitril im Gemisch mit Wasser) und verdampfbaren Puffersalzen (z.B. Ammoniumacetat) betrieben werden. Leider sind die zugrunde liegenden Standard-HPLC-UV-Methoden sehr oft nicht MS-kompatibel, da sie auf nicht-flüchtigen Lösungsmittelsystemen beruhen (z.B. Phosphatpuffer). Ein Nachteil der HPLC-MS-Kopplung ist häufig die geringe Ionisierbarkeit der Verunreinigungen. So kann z.B. eine Verunreinigung mit einem deutlichen UV-Signal im Massenspektrum kein oder nur ein kleines Signal zeigen und damit eine Interpretation unmöglich machen. Dies lässt sich durch Anwendung verschiedener Ionisierungstechniken umgehen. Abbildung 3 zeigt die Auswirkung verschiedener Ionisierungstechniken auf den Response der Verunreinigungen im Chromatogramm.

• Die präparative Isolierung von Verunreinigungen kommt meist dann zum Einsatz, wenn weitergehende Prüfungen an der Substanz gemacht werden sollen (z.B. NMR-Messungen) oder wenn geringe Mengen als Vergleichssubstanz für andere chromatographische Methoden benötigt werden. Dabei werden mithilfe eines präparativen HPLC-UV-Systems kleine Mengen (0,2 bis 1 mg) der Verunreinigung durch Peak-Fraktionierung isoliert und aufkonzentriert.

• Der direkte Weg zur Strukturaufklärung führt über die mehrdimensionale NMR-Spektroskopie. Mithilfe der NMR-Spektroskopie ist es möglich, die Konstitution und relative Konfiguration und damit die exakte Struktur einer Verunreinigung aufzuklären. Leider benötigt die NMR-Spektroskopie vergleichsweise hohe Substanzmengen (ab ca. 250 µg), die eine hohe Reinheit aufweisen sollten. Dies liegt an der, im Vergleich zur HPLC-MS, geringen Empfindlichkeit der Methode. Eine schlechte Reinheit der Substanzen führt zu zusätzlichen Signalen im NMR-Spektrum, welche eine Strukturzuordnung erschweren oder gar unmöglich machen. Deshalb sollten die zu untersuchenden Substanzen vor der spektroskopischen Untersuchung mithilfe chromatographischer Methoden aufgereinigt werden. Die IR-Spektroskopie kann ebenfalls unterstützend zur Strukturaufklärung eingesetzt werden. Sie benötigt weniger Substanzmengen als die NMR-Spektroskopie, jedoch ist ihre Aussagekraft auch deutlich geringer.

• Im Bereich der Strukturaufklärung gibt es wenige hilfreiche Software-Tools. Meist handelt es sich um Spektrenbibliotheken (GC-MS) oder Simulationssoftware (NMR, MS). Diese können unterstützend eingesetzt werden, z.B. um Fragmentierungspfade oder chemische Verschiebungen abzuschätzen, ersetzen aber nicht die Erfahrung des Analytikers.

Literatur:

[1] ICH-Richtlinien Q3A(R2), Q3B(R2), M7, www.ich.org

[2] A.J. Hickey, D.Ganderton, Unit Processes in Pharmacy Unit Operations, Encyclopedia of Pharmaceutical Technology 4th Edition, ed. J. Swarbrick und J. Boyle, Marcel Dekker, New York, 2002

* Dr. R. Nussbaum: Analytical Services Dr. Ralph Nussbaum, 52068 Aachen

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