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Unterschied überwinden

Rund 1.000 Proben untersuchten Knoop et al. auf das Vorhandensein von SARS-CoV-2 und zwar auf unterschiedliche Art. Die klassischerweise mit der Nadel aus der Vene entnommenen und in Blutentnahmeröhrchen angelieferten Vollblutproben werden jeweils zentrifugiert und sind dann für die Immunassay-Analyse (Eclia) einsatzbereit. Für die Analyse von Trockenblutproben (DBS) werden rund 20 µL Kapillarblut aus der Fingerbeere entnommen und auf zellulosebasierten DBS-Karten gesammelt, die unmittelbar verpackt und bis zur Analyse bei Zimmertemperatur trocken gelagert werden. Zur Extraktion der Antikörper werden definierte blutgetränkte Bereiche aus dem DBS gestanzt, in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, mit 100 µL EDTA-Lösung versetzt und zehn Minuten mit Ultraschall behandelt. Im Anschluss an die folgende Zentrifugation sind die Extrakte für die Immunassay-Analyse zu verwenden.

Diese kurze Beschreibung deutet an, dass die Analyse von DBS eine Reihe von Arbeitsschritten mehr umfasst als die Untersuchung klassischer Blutproben. Dessen ungeachtet spiegele die minimalinvasive DBS-Blutentnahme insbesondere im Rahmen der serologischen Dia­gnostik bei Infektionskrankheiten wesentliche Mehrwerte, nämlich eine schnelle und einfache Möglichkeit der individuellen, sprich kontaktlosen Blutentnahme, einen einfachen, sicheren und kostengünstigen Einsatz und Transport der DBS-Karten sowie eine hohe Lagerstabilität der Proben, schreiben Knoop et al.

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Automatisierung entscheidet

Zünglein an der Waage ist die Automatisierung der DBS-Analytik, und zwar nicht allein, um die Effizienz der Probenvorbereitung und damit der Analytik insgesamt zu erhöhen, sondern auch um eine in Epidemie- und Pandemiezeiten zu erwartende große Anzahl an Proben zeitnah zu bearbeiten und schnell an wichtige Informationen zu gelangen. Knoop et al. nutzen für ihre Bestimmung einen kommerziell verfügbaren DBS-Autosampler auf Basis eines Multi-Purpose-Samplers (Gerstel-MPS); die gewonnenen Extrakte für die sich anschließende ELISA-Bestimmung werden automatisiert in Probenfläschen abgefüllt.

Erste Erfahrungen im Einsatz der automatisierten Dried-Blood-Spot-Analytik hatte man am Institut für Biochemie an der Deutschen Sporthochschule Köln bereits im Zusammenhang mit dem Nachweis illegaler leistungssteigender Substanzen gewonnen [2]. Auf dieser Basis ließ sich ein automatisierter Workflow für die serologische/immunologische Bestimmung von SARS-CoV-2-Antigenen entwickeln [1]. Hier wie dort wird die DBS-Karte mit der getrockneten Blutprobe ins Rack des DBS-Autosamplers (s. Abb. 4) gestellt, weitere manuelle Arbeitsschritte entfallen. Die anschließende automatisierte Extraktion und Analyse gestaltet sich nach Knoop et al. wie folgt:

Der Autosampler transportiert die DBS-Karten zu einer Kamera, um mittels einer integrierten Bilderkennungssoftware die Lage des getrockneten Blutstropfen zu bestimmen und dessen Qualität zu bewerten. Anschließend wird die Karte ins Desorptionsinterface bewegt, in dem eine definierte Fläche des Blutstropfens (2 bis 8 mm Durchmesser) vom Lösungsmittel durchströmt wird, um die Analyten zu desorbieren (Flow Through Desorption, FTD). Zur Antikörperextraktion verwenden die Forschenden eine wässrige EDTA-Lösung (1,8 g/L), die mit einem segmentierten Volumen von 85 μL durch die Kapillaren transportiert wird. Um Verdünnungseffekte zu vermeiden, wird das Volumen, wie Knoop et al. schreiben, durch Injektion von Luft anstelle anderer Lösungsmittel oder Wasser durch das System und das Kartenmaterial gedrückt. Unmittelbar vor dem Passieren des Probenspots werde der Durchfluss auf 250 μL/min reduziert und die EDTA-Lösung durch einen eingebauten Vorwärmer auf ca. 80 °C erhitzt. Der resultierende Extrakt wird schließlich in offene Fläschchen überführt, aus denen aliquote Teile zur Immunassay-Analyse entnommen werden (detailliertes Extraktionsprotokoll siehe [1]).

Nach der Desorption, dem Waschen und Trocknen wird, wie die Forschenden weiter ausführen, zu Qualitätskontroll- und Dokumentationszwecken ein weiteres Foto der Karte aufgenommen, bevor sie dann vom Sampler auf die jeweilige Rackposition zurückbefördert wird. „Aufgrund der Anforderungen an die unverdünnte Extraktion beträgt die Gesamtextraktionszeit pro Spot etwa sieben Minuten. Assays, die mehr verdünnte Extrakte akzeptieren, sind mit vereinfachten Extraktionsprotokollen kompatibel, die eine reduzierte Laufzeit von circa drei Minuten pro DBS ermöglichen“, schreiben Knoop et al.

Analysentechnik

Eine Epidemie oder Pandemie rasch einzudämmen, ist geboten, um die Zahl potenzieller Opfer möglichst gering zu halten. Der Bedarf an erweiterten SARS-CoV-2-Antikörper-Testmethoden könnte sich in naher Zukunft weiter erhöhen, sind Knoop et al. überzeugt, um neben der Identifizierung vergangener Infektionen weitere Fragen zu beantworten, etwa in puncto Beurteilung der Immunantwort auf unterschiedliche Impfstrategien und Therapeutika oder im Zusammenhang mit der Langzeitüberwachung des Immun- und Antikörperstatus ehemals infizierter oder geimpfter Personen. Die Bestimmung des Antikörpertiters spiele in diesem Kontext eine wichtige Rolle, vorzugsweise erzeugt mit einer weitgehend automatisierten Extraktions- und Analyseoption, für die die Forschenden in ihrer Studie Proof-of-Principle-Daten und Strategien erarbeitet und präsentiert haben.

Referenzen:

[1] Andre Knoop, Hans Geyer, Oliver Lerch, Ana Rubio, Yvonne Schrader, Mario Thevis, Detection of anti-SARS-CoV-2 antibodies in dried blood spots utilizing manual or automated spot extraction and electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA), Analytical Science Advances (2021), https://doi.org/10.1002/ansa.202100009

[2] Guido Deußing, Dopingfahnder auf der Überholspur, Laborpraxis 06 (2020) 46-48, https://www.laborpraxis.vogel.de/effiziente-dopinganalytik-per-automatisierter-dried-blood-spot-analyse-a-943343/

* *G. Deußing, Redaktionsbüro Guido Deußing, 41464 Neuss

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