Was ist in der Schokolade drin?

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HPLC-Säulen mit unterschiedlichen Selektivitäten

In einer komplexen Probenmischung, wie in Schokolade, sind häufig neutrale neben lipophilen Komponenten zu finden, aber auch polare oder geladene Bestandteile. Bei der Methodenentwicklung für eine zweidimensionale chromatographische Trennung sollte man deshalb die Säulen so wählen, dass diese unterschiedliche Selektivitäten haben. Der einfachste Ansatz der Säulenauswahl ist eine Kopplung von zwei Umkehrphasen RPxRP; hierbei gibt es keine Probleme mit der Mischbarkeit der Eluenten oder mögliches Ausfallen von Salzen bei konzentrierten Pufferlösungen. Auch lässt sich durch die Auswahl unterschiedlicher Zusätze oder organischer Lösungsmittel die Selektivität zusätzlich beeinflussen.

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Abb. 2: Systemaufbau der Nexera-e (zweidimensionales HPLC System)

Abb. 3: Erstellen des 2D-Zeitprogramms mithilfe des LCxLC-Assist

Abb. 4: Standard-Injektion von möglichen Schokoladen-Inhaltsstoffen mit PDA-Detektion

Abb. 5: Analyse von Chili-Schokolade mit MS-Detektion

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Für die Analyse der Inhaltsstoffe aus Schokolade wurde für die erste Dimension eine Säule mit kleinem Durchmesser ausgewählt, die hydrophobe Eigenschaften besitzt und somit die unpolaren Analyten länger festhält (ACE 3 Super C18, 150 x 1 mm, 3 µm). Die Säule der zweiten Dimension hingegen besitzt polare Eigenschaften und erhöht damit die Retention von polaren Analyten (ACE Excel 2 C18-Amide, 100 x 2,1 mm, 2 µm).

Für das Erstellen der Gradienten für die erste und zweite Dimension ist es wichtig, den kontinuierlichen langsamen Gradientenanstieg der ersten Dimension auch für den Gradienten der zweiten Dimension zu berücksichtigen. Wie in Abbildung 3 ersichtlich, gibt es hierfür eine moderne LCxLC-Assist-Software, die es ermöglicht, die Startbedingungen des Gradienten der zweiten Dimension über die ganze Analyse dynamisch anzupassen.

In der Entwicklung der zweidimensionalen analytischen Methode für die Bestimmung der Inhaltsstoffe von Schokolade, wurden die separaten Gradiententrennungen optimiert und mithilfe der LCxLC-Software kombiniert.

Analytische Methode der comprehensive LCxLC

Die Trennung in der ersten Dimension erfolgte nach folgender Methode:

Säule: ACE 3 Super C18, 150 x 1 mm, 3 µm

Eluenten: A: 10 mM HCOONH₄, pH 2,8; B: 10 mM HCOONH₄, pH 2,8 in MeOH/H₂O (90:10)

Flussrate: 0,01 ml/min

Temperatur: 42 °C

Gradient: 25% B (0 min) – 100% B (60 min) – 100% B (69 min) – 25% B (70 min) – 25% (90 min)

Die Trennung in der zweiten Dimension erfolgte nach folgender Methode:

Säule: ACE Excel 2 C18-Amide, 100 x 2,1 mm, 2 µm

Eluenten: A: 10 mM HCOONH₄, pH 2,8; B: 10 mM HCOONH₄, pH 2,8 in MeCN/H₂O (90:10)

Flussrate: 1,2 ml/min

Temperatur: 42 °C

Gradient: 5% B (0 min) – 85% B (1,50 min) – 5% B (1,51 min) – 5% B (2,00 min)

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