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PROTEOMICS

Welche Bedeutung hat LC in der Proteomforschung?

| Redakteur: Marc Platthaus

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Anton Mayer?Vertriebsleiter?Hypersil Produkte, Thermo Electron?Die schnelle und effiziente Identifikation von Proteinen ist notwendig, um den Mechanismus verschiedenster Erkrankungen aufzuklären. Bei Detektion und Identifikation von Proteinen in Proteomics und Drug Discovery ist die HPLC ein unverzichtbares Werkzeug zur vorhergehenden Trennung und Isolation bzw. Fraktionierung. Durch die andauernde Notwendigkeit, die bereits erzielten Resultate zu verbessern, sind Firmen wie Thermo Electron stets bestrebt, neue chromatographische Säulenmaterialien zu entwickeln und die Säulendimensionen zu minimieren (Microbore, Nanobore und kleiner). Diese Optimierung von Selektivität, Effizienz und Zuverlässigkeit von LC/MS-unterstützten Analysen in Proteomics, Metabolomics und Metabonomics ist das erklärte Ziel unserer zukünftigen Aktivitäten, damit Wissenschaftlern eine schnelle, einfache und akkurate Identifikation eines Großteils des Proteinpools ermöglicht wird. Die zukünftige Entwicklung klein dimensionierter Säulen mit geringerem Innendurchmesser, kombiniert mit neuartigen stationären Phasen, die kleinere oder gar keine Partikel mehr beinhalten (Monolithische Packungen), ist der Grundstein für die Verbesserung von Hochdurchsatzkapazität und Empfindlichkeit der Trennaufgaben, die im Rahmen der Analyse von körpereigenen biologischen Makromolekülen und Metaboliten anfallen.??

Regina Römling?Produktspezialistin?für HPLC-Analytik?ShimadzuIn der Proteomforschung ergänzt oder ersetzt die Flüssig-Chromatographie vermehrt die traditionelle 2D-Gel-elektrophorese, weil die LC bei überragender Reproduzierbarkeit vollständig automatisiert werden kann. Eine ausreichend hohe Auflösung wird durch die Kopplung von zwei oder mehr Trennprinzipien in einem sog. multidimensionalen HPLC (MDLC)-System realisiert. Kapillar- oder Nanosäulen sorgen für maximale Empfindlichkeit. Shimadzu bietet solche Systeme individuell konfiguriert an - basierend auf der modularen LC-10AVP Produktlinie. Des weiteren ist die Detektion entscheidend. MDLC-Systeme werden üblicherweise mit Tandem- oder Hybrid-Massenspektrometern gekoppelt. Da Shimadzu HPLC-Systeme von den gängigen MS-Softwarepaketen angesteuert werden, sind Kopplungen mit verschiedensten MSn-Detektoren möglich. Basierend auf der Technologie des be?Regina Römling?Produktspezialistin?für HPLC-Analytik?ShimadzuIn der Proteomforschung ergänzt oder ersetzt die Flüssig-Chromatographie vermehrt die traditionelle 2D-Gel-elektrophorese, weil die LC bei überragender Reproduzierbarkeit vollständig automatisiert werden kann. Eine ausreichend hohe Auflösung wird durch die Kopplung von zwei oder mehr Trennprinzipien in einem sog. multidimensionalen HPLC (MDLC)-System realisiert. Kapillar- oder Nanosäulen sorgen für maximale Empfindlichkeit. Shimadzu bietet solche Systeme individuell konfiguriert an - basierend auf der modularen LC-10AVP Produktlinie. Des weiteren ist die Detektion entscheidend. MDLC-Systeme werden üblicherweise mit Tandem- oder Hybrid-Massenspektrometern gekoppelt. Da Shimadzu HPLC-Systeme von den gängigen MS-Softwarepaketen angesteuert werden, sind Kopplungen mit verschiedensten MSn-Detektoren möglich. Basierend auf der Technologie des be?Jean-Pierre Chervet?Managing Director?LC Packings - ?A Dionex CompanyIm Gegensatz zur Analyse des menschlichen Genomes, die im Jahre 2000 vollendet wurde und mit ?40000 bis 45000 Genen den genetischen Aufbau des Menschen beschreibt, ist das Proteom wesentlich komplexer und vielseitiger. Vermutungen gehen von der Existenz von mindestens 500000 Proteinen aus, von denen wiederum ein Großteil Veränderungen eingeht durch post-translationale Modifikationen, Bildung von Proteinkomplexen und in der Dynamik, usw. Um diese Vielzahl differenzieren zu können, sind hochwertige Analysenmethoden wie die 2D-Gelelektrophorese (2D-PAGE) und in zunehmendem Maße die Kapillar/Nano-HPLC mit MS-Kopplung unerlässlich. ?Welche Rolle der HPLC im Bereich der Proteomics in zehn ?Jahren zukommen wird, ist natürlich schwierig vorherzusagen. Dass der Term „Proteomics“ noch nicht einmal zehn Jahre lang existiert, zeigt deutlich, wie schnell heutzutage neue Technologien entstehen oder Altbewährtes über Nacht obsolet wird. Zweifelsohne werden Trenntechnologien wie die HPLC auch in zehn Jahren noch von entscheidender Bedeutung sein, nicht zuletzt aufgrund der oben erwähnten Komplexität des menschlichen Proteoms. Neben selektiven Trennmedien (wie z.B. Affinität, GPC, Hydrophobizität) von höchster Trennleistung (submikron Teilchengröße, Monolithen, usw.) wird die Miniaturisierung auch weiterhin eine entscheidende Rolle spielen. Pico-LC ist hierfür notwendig, um Empfindlichkeiten im subatmol-Bereich handhaben zu können und um auch den extremen dynamischen Bereich der Proteinkonzentrationen von bis zu 1:10-10 abzudecken. Darüber hinaus werden Multiplex-LC-Systeme höchstwahrscheinlich im Chipformat ihren Einzug gehalten haben. Dem Erfolg der LC zur selektiven Probenvorbereitung und/oder als hochwertiges Trennsystem für die MS-Kopplung steht nur wenig im Wege. ?Fragwürdig ist schon eher, ob die verschiedenen Forschungsinstitute oder „Big Pharma“ genügend Erfolge in der Proteomforschung buchen werden (beispielsweise lead discovery, biomarkers), um die nötigen Investitionen auch für die nächsten zehn Jahre für diese doch vielversprechende Technologie sicherzustellen.?Rudolf Grimm?Proteomics Market De-velopment Manager?Agilent TechnologiesDas Auftrennen und Identifizieren von Proteinen in komplexen Gemischen steht im Mittelpunkt von Proteomics. Die multidimensionale Chromatographie online oder offline gekoppelt mit der Massenspektrometrie zur Auftrennung und Analyse tryptischer Spaltungen hat sich in den letzen beiden Jahren als alternative bzw. komplementäre Methode zur 2D-PAGE etabliert. Hierdurch können membranständige, sehr basische, saure, kleine und große Proteine analysiert werden, die in der 2D-PAGE verloren gehen. Ein weiterer Vorteil liegt in der vollständigen Automatisierung der LC-MS-Methoden, wodurch sicherlich in Zukunft noch mehr Wissenschaftler diese Methodik anwenden werden. Weiterhin hat sich herausgestellt, dass LC-MS-Methoden wie z.B. die von Prof. Vandekerckhove und Team entwickelte Cofradic Methode ca. 100x sensitiver ist als 2D-?PAGE. Durch die Möglichkeit mehrdimensional zu arbeiten erschließt sich der Zugang zu den hoch interessanten „low-abundance“-Proteinen. Zudem zeigte sich in zahllosen Publikationen, dass mit Hilfe der multidimensionalen Chromatographie deutlich mehr Proteine in einem analytischen Ansatz im Vergleich zur 2D-PAGE Analytik identifiziert werden können. Weitere Entwicklungen in der Zukunft sind sicherlich im Bereich von neuen ?Säulenmatrices zu erwarten, die sowohl eine deutlich schnellere Auftrennung von Peptiden wie auch von Proteinen erlauben werden. Inwieweit die multidimensionale LC für die Auftrennung von komplexen Proteingemischen elektrophoretische Verfahren verdrängen wird, hängt entscheidend auch von der Verfügbarkeit neuer, robuster hochauflösender Säulen ab, die auch eine hohe Wiederfindungsrate zeigen. Ein Trend zur Kombination von HPLC- Auftrennungen mit elektrophoretischen Methoden wie der 1D-PAGE als alternative zur 2D-PAGE ist zumindest heute bereits ?erkennbar. Die Miniaturisierung von Säulen und Schaltventilen sowie die Integration von Probenvorbereitung in eine einzige Analysenplattform wie einem Chip wird ein weiterer wichtiger Schritt für das Vordringen in neue Sensitivätsbereiche der Proteomanalyse erbringen. So wird die HPLC als „Front-End“-?Methode für die Probenpräparation für die anschließende massenspektrometrische Analyse zunehmend an Bedeutung ge-?winnen.?Gerhard Kratz?Key Account Manager HPLC Europe, ?Tosoh BioscienceIn der Proteomforschung wird bis dato überwiegend mit der 2D-Gelelektrophorese gearbeitet. Nachteil elektrophoretischer Techniken ist jedoch u.a. oft der Verlust der biologischen Aktivität. Es lag daher nahe diese Nachteile durch die Vorteile der HPLC, unter Beibehaltung der biologischen Aktivität, zu kompensieren. Multidimensionale Kapillar-HPLC, besser, eine Kaskade der an die jeweilige biochemische Problemstellung gezielt angepassten Reihenfolge chromatographischer Techniken, wie sterische Ausschluss (SEC)-, Ionenaustausch(IEX)-, Hydrophobic-Interaction (HIC)-, aber auch Reversed-Phase-Chromatographie (RPC) scheint deshalb eine sinnvolle, effiziente Ergänzung zur 2D-Gelelektrophorese nicht nur für die Analyse von Proteomen zu sein. Aus diesem Grund hat Tosoh Bioscience damit begonnen, sich speziell für die Proteomforschung mit Kapillarsäulen zu beschäftigen. Die ersten Ergebnisse liegen nun mit SEC-Kapillaren vor, und in wenigen Monaten können die ersten Kapillaren zum Nutzen der Anwender angeboten werden.?Andreas Gügel?Andreas Gügel?Produktspezialist HPLC?Gilson ?Die Bedeutung von Proteomics u.a. bei der Entwicklung neuer Arzneimittel wird ohne Zweifel in den nächsten Jahren noch weiter zunehmen. Dabei werden erheblich leistungsfähigere Techniken von Nöten sein, um die steigenden Anforderungen an Trennleistung, Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit zu erfüllen. So steht z.B. zu erwarten, dass die „althergebrachte“ 2D-Gelelektrophorese zunehmend durch die leistungsfähigere 2D-HPLC im Mikro- bzw. Nanoliterflussbereich ergänzt oder gar verdrängt wird. Wünschenswert sind hierbei Systeme, die die Probenvorbereitung, die Trennung auf Kapillarsäulen und den Substanznachweis mittels MS- und UV-Detektion in einem vereinen. Besondere Bedeutung wird Ventilschaltungen für die zweidimensionale Chromatographie (z.B. IEC kombiniert mit RP) und der Bedienungsfreundlichkeit, die der eines herkömmlichen HPLC-Systems in nichts nachstehen sollte, zukommen. Diesen sich verändernden Anforderungen wird die Firma Gilson International mit einem neuen splitlosen Nanoliter-HPLC-System gerecht.??Norbert Wenkel?Prokurist und Geschäftsbereichs-?leiter Bio-Analytik, Axel Semrau?Proteomic soll die Interaktionen der Proteine in den Zellen analysieren. Ziel der Proteomic-Forschung ist es, eine möglichst große Anzahl von Proteinen zu beobachten, zu identifizieren und zeitliche Veränderungen zu registrieren. Als Primäranalyseverfahren sind hier die 2D-?Gelelektrophorese (2DGE) und massenspektrometrische Verfahren zu nennen. Mittlerweile können in industriellen Hochdurchsatzanalysen durchschnittlich 50-90% der auf einem 2D-Gel getrennten Proteine durch MALDI-TOF identifiziert werden. Weitere 10-20% sind durch Tandem-MS identifizierbar. Eine Kopplung von MS-Verfahren mit chromatographischen Trenntechniken (HPLC) hat sich in der Praxis nicht nur bewährt, sondern ist aufgrund der großen Anzahl zu untersuchender Proteine notwendig. Geringe Probenmengen und komplexe Proben auf der Probenaufgabeseite und der Notwendigkeit dem MS hinreichend Messzeit zur Verfügung zu stellen, schreiben bei diesen Kopp-lungen geringste Flussraten (10-500nl/min) und die Verwendung von Kapillartrennsäulen vor. Aus der Vorgabe der Proteomic-Forscher, niedrige Flussraten reproduzierbar direkt und ohne Verwendung von Flowsplittersystemen bereitzustellen entstand durch Zusammenarbeit der Firmen MDS/SCIEX und Eksigent ein neues NanoLC-System. Das Eksigent NanoLC-System ist ein hochpräzises, flowsplitterfreies binäres Micro-Flusssystem für micro- und nano-LC-Fragestellungen. Flussabhängige Applikationen, wie sie gerade in der Proteomics nötig sind, werden mit dem Eksigent NanoLCSystem einfach und reproduzierbar durchführbar.

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