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Liquid Handling

Wissenschafts-Expedition untersucht den Umgebungseinfluss auf das Pipettieren

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Mission 2: Thermische Unterschiede

Im Yellowstone National Park untersuchten die Wissenschaftler den Einfluss von Temperaturunterschieden auf das Pipettieren. Flüssigkeiten müssen bei Labortests und laut Protokoll häufig bei Temperaturen verarbeitet werden, die sich von der Temperatur der Pipette unterscheiden. So werden Restriktionsenzyme bei Nukleinsäureverfahren häufig bei Eistemperatur (0 °C) verarbeitet, wogegen beim Arbeiten mit Säugerzellkulturen (37 °C) oder bei Polymerase-Kettenreaktionen (PCR, 60 °C oder höher) höhere Temperaturen zum Einsatz kommen.

Die Wissenschaftler ermittelten, dass die Pipetten bei kalten Flüssigkeiten zu große Mengen und bei warmen Flüssigkeiten zu kleine Mengen abgaben. Die Ungenauigkeiten erreichten dabei sogar Werte bis zu 37%. Die im Yellowstone-Nationalpark gesammelten Werte zeigten zudem, dass die durch thermisches Ungleichgewicht verursachten Abweichungen am größten waren, wenn kleinvolumige Pipetten verwendet wurden, die auf ihr Mindestvolumen eingestellt waren. Darüber hinaus sind Pipetten für die Verarbeitung kleinerer Volumina stärker betroffen als Pipetten für größere Volumina. Wie schon beim Luftdruck hängen auch die durch das thermische Ungleichgewicht verursachten Volumenunterschiede mit dem Luftverdrängungsprinzip der Pipetten zusammen.

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Eine variable 2-µl-Pipette, die auf ihr Mindestvolumen eingestellt war, gab bei kalten Flüssigkeiten 37% zu viel und bei warmen Flüssigkeiten 23% zu wenig Flüssigkeit ab – verglichen mit Flüssigkeiten auf Umgebungstemperatur. Bei Einstellung auf das Maximalvolumen gab dieselbe Pipette 1% zu viel kalte Flüssigkeit und 7% zu wenig warme Flüssigkeit ab.

Beim Arbeiten mit größeren Flüssigkeitsvolumina traten auch wie erwartet Fehler auf, diese fielen jedoch erheblich geringer aus. Beim Dispensieren von kalter Flüssigkeit war mit einer 20-µl-Pipette bei Einstellung auf das Mindestvolumen ein Fehler von 4% zu verzeichnen. Demgegenüber stand ein Fehler von 37% bei Verwendung einer 2-µl-Pipette, die ebenfalls auf das Mindestvolumen eingestellt war. Die Verwendung einer 20-µl-Pipette bei Minimalvolumen führte zu größeren Fehlern als bei der Nutzung einer 2-µl-Pipette am Maximalvolumen. Wenn 2-µl verlangt sind, ist es daher besser, eine 2-µl-Pipette zu nutzen.

Wie schon beim Luftdruck hängen auch die durch das thermische Ungleichgewicht verursachten Volumenunterschiede mit dem Luftverdrängungsprinzip der Pipetten zusammen. Wenn die Pipettenspitze in eine warme Flüssigkeit eingetaucht wird, hat die Luft in der Spitze Umgebungstemperatur. Nach dem Eintauchen in das Gefäß mit der warmen Flüssigkeit befindet sich die Pipettenspitze nun in einer warmen Mikroumgebung. Über den Zeitraum des Ansaugens erwärmt sich die Pipettenspitze, wodurch sich das eingeschlossene Luftpolster ausdehnt und Flüssigkeit aus der Spitze herausdrückt. Dies führt dazu, dass weniger Flüssigkeit angesaugt und dispensiert wird und es entsteht folgerichtig eine Abweichung zwischen dem Sollvolumen und dem tatsächlich abgegebenen Volumen.

Beim Pipettieren kalter Flüssigkeiten tritt der entgegengesetzte Effekt auf. Wenn die Pipette in eine kalte Mikroumgebung eingetaucht wird, schrumpft das Volumen des eingeschlossenen Luftpolsters, so dass mehr Flüssigkeit angesaugt und nachfolgend dispensiert wird.

Korrektur von Fehlern, die durch ein thermisches Ungleichgewicht verursacht werden

Im Gegensatz zur Höhe handelt es sich beim thermischen Ungleichgewicht um ein dynamisches Phänomen. Während Pipetten bei warmen Flüssigkeiten konsistent unterdispensierten und bei kalten Flüssigkeiten konsistent überdispensierten, unterliegt das Ausmaß der Volumenabweichung gewissen Schwankungen. Dies ist zum Teil darauf zurückzuführen, dass sich Flüssigkeiten mit der Zeit an ihre Mikroumgebung anpassen.

Je länger sich eine Pipette in einer warmen Umgebung befindet, desto wärmer wird das Volumen des eingeschlossenen Luftpolsters. Dies führt zu einer stärkeren Volumenausdehnung und einer größeren Auswirkung auf das Volumen. Das Ausmaß des durch ein thermisches Ungleichgewicht verursachten Fehlers ist daher von verschiedenen protokollspezifischen Faktoren abhängig, so z. B. von der Pipettiergeschwindigkeit, der Art des Probenbehälters, dem Volumen des Luftpolsters in der Pipettenspitze usw. Eine allgemein gültige Standardlösung gibt es nicht.

Es gibt jedoch verschiedene Maßnahmen, die ergriffen werden können, um das Risiko von Volumenabweichungen möglichst gering zu halten. Dazu gehören die Äquilibrierung der Flüssigkeiten auf die Temperatur der Umgebung und des Liquid-Handling-Geräts und die Minimierung des Luftpolsters, indem möglichst nahe am Maximalvolumen pipettiert wird. Darüber hinaus sollte die Pipettenspitze nur so kurz wie möglich warmer oder kalter Flüssigkeit bzw. Mikroumgebung ausgesetzt werden.

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