Proteinbiosynthese Zellfreie Proteinbiosynthese

Die Entwicklungen im Bereich der Genom- und Transkriptom-Untersuchungen lieferten in den letzten Jahren unzählige Daten zur Zusammensetzung „der mRNA“ einer Zelle. Unter Hochdruck versuchen Labore, den zehn- bis hunderttausenden Sequenzen Funktionen zuzuordnen.

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Mit der Zunahme an Proteinsequenzen ohne zugeordnete Funktion steigt der Bedarf an effektiven Proteinsynthesesystemen für die Bereitstellung von Proteinen für nachgeordnete Funktions- und Strukturuntersuchungen enorm. Die Methode der zellfreien Proteinbiosynthese erlebt aus diesem Grund seit einigen Jahren eine Renaissance, da sie es erlaubt, die notwendigen Schritte von DNA und RNA zu Protein schneller und mit weniger Aufwand zu gehen. Doch auch für kleine Ansätze im Labor bietet die zellfreie Proteinbiosynthese attraktive Vorteile gegenüber dem klassischen Weg der Proteinexpression in Zellen.

Neben Schnelligkeit und Reinheit bietet die zellfreie Proteinbiosynthese nahezu unbegrenzte Variationsmöglichkeiten, die über die Grenzen der klassischen zellulären Proteinexpression weit hinausgehen. Dies sei anhand des folgenden Beispiels verdeutlicht: Bei der Proteinsynthese ist neben der vollständigen Synthese der Polypeptidkette die richtige Faltung von elementarem Interesse. Nur so kann ein Protein seine native Funktion korrekt ausüben. Da zellfreie Systeme offene Systeme sind, erlauben sie bereits während der Proteinsynthese die Zugabe milder Detergenzien oder anderer Zusätze, die eine richtige Faltung des Proteins von Anfang an begünstigen. Lebende Zellen vertragen Detergenzien kaum, weil hierdurch die lebenswichtigen Membranen destabilisiert, perforiert oder sogar aufgelöst werden. Auch die Zugabe hochmolekularer Additive, beispielsweise Chaperone, Aminoacyl-tRNAs oder Lipidmembranen, oder eine Anpassung des Reaktionsmilieus ist im Hinblick auf die Synthese bestimmter Proteinklassen (Disulfidbrückenproteine, Membranproteine etc.) in zellfreien Systemen leicht möglich. Ein weiterer Vorteil ist die wesentlich erleichterte Aufreinigung von Proteinen aus Lysaten mit definierter Zusammensetzung, die oft sogar zu höheren Proteinaktivitäten als bei der in vivo Expression von Proteinen führt. Und wo wir gerade dabei sind: Auch die bei Zellbiologen sonst allgegenwärtige Sorge um Zellvitalität, Mutationen, Kontaminationen, Gefahrenstufen usw. entfällt bei der in vitro Synthese.

Reaktionen im kleinen Maßstab

Zellfreie Systeme erlauben es, Reaktionen auch in sehr kleinem μl-Maßstab und in vielfach parallelen Ansätzen durchzuführen, was ideal für ein erstes Screening interessanter cDNAs oder für das Austesten geeigneter Reaktionsparameter sein kann. Mittlerweile sind neben E. coli - basierten Systemen zellfreie Systeme aus verschiedensten Zelltypen und Organismen, beispielsweise aus Weizenkeimen, Retikulozyten und Insektenzellen verfügbar, die das Spektrum funktionell darstellbarer Proteine beträchtlich erweitern und zum Teil sogar eine Synthese von membranintegrierten Proteinen und posttranslational modifizierten Proteinen ermöglichen. Eine besondere Domäne der zellfreien Proteinbiosynthese ist auch die Herstellung von Proteinen mit besonderen artifiziellen Aminosäuren.

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