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MIKROBIOLOGIE Blutkulturdiagnostik - Vergleich der Verfahren

Autor / Redakteur: UTE AUERBACH* / Gerd Kielburger

Bakteriämie und Sepsis stellen immer noch ein großes Problem in der medizinischen Versorgung dar. Blutkulturdiagnostik bietet eine wichtige Möglichkeit, systemische, mit Bakteriämie oder Fungämie einhergehende Infektionen zu diagnostizieren.

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Trotz einer stetigen Verbesserung der medizinischen Versorgung stellen Bakteriämie und Sepsis immer noch ein großes Problem in der medizinischen Versorgung dar und gehen mit hoher Letalität einher. Die Blutkulturdiagnostik bietet eine wichtige Möglichkeit, systemische, mit Bakteriämie oder Fungämie einhergehende Infektionen zu diagnostizieren.

Für die Blutkulturdiagnostik ist eine schnelle und zuverlässige Methode gefordert mit dem Ziel der Speziesidentifizierung und dem Erstellen eines Antibiogramms inklusive der Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) sowie des Aufdeckens von Resistenzmechanismen. In den letzten 20 Jahren lag der Schwerpunkt bei der Weiterentwicklung in der Verbesserung der Sensitivität und der Optimierung der Zeit bis zur endgültigen Diagnosestellung.

Indikation

Im klinischen Alltag werden die Bakteriämien eingeteilt in transiente, intermittierende und kontinuierliche Bakteriämien. Während mechanische und chirurgische Manipulationen besiedelter und infizierter Gewebe zu einer transienten Bakteriämie führen können, bilden Abszesse und Katheter den Focus möglicher intermittierender Bakteriämien. Zur kontinuierlichen Bakteriämie kommt es typischerweise bei intravaskulären Infektionen, wie Endokarditis, septischen Thrombosen und mykotischen Aneurysmata [1, 10]. Weitere Krankheitsbilder, die mit einer Bakteriämie einhergehen können und somit eine Blutkulturdiagnostik erforderlich machen, sind die Meningitis, Pneumonie, Cholangitis, Osteomyelitis, Urosepsis sowie seltene Krankheiten, wie Typhus, Leptospirose und Brucellose.

Klinische Zeichen des SIRS („Systemic Inflammatory Response Syndrome“: Temperatur >38 °C oder <36 °c, erhöhte atemfrequenz oder erniedrigter paco2, herzfrequenz, leukozytenzahl>12,0 x109/l oder <4,0 x 109/l), CRP-Erhöhung, BSG-Erhöhung sowie Bewusstseinstörungen und neurologische Symptome stellen die Indikationen für die Entnahme von Blutkulturen. Liegt die Ursache eines SIRS in einer Bakteri-, Vir- oder Fungämie, spricht man von Sepsis, die wiederum in verschiedenen Schweregraden bis hin zum septischen Schock auftreten kann. Bei immunsupprimierten Patienten sollte bereits beim alleinigen Auftreten von Fieber eine Blutkulturdiagnostik erfolgen [9].

Durchführung

Während einer Bakteriämie eines Erwachsenen beträgt die Konzentration der Mikroorganismen < 1-10 Kolonie-bildende Einheiten (KBE) pro ml Blut. Mittels peripherer Venenpunktion sowie über zentrale Verweilkatheter wird daher unter sterilen Bedingungen ein Volumen von 10- 20 ml entnommen, das je zur Hälfte in eine Kulturflasche zur aeroben und zur anaeroben Bebrütung überführt wird, um ein größeres Erregerspektrum zu erfassen [8, 10, 11]. Kommerziell erhältliche Kulturflaschen beinhalten ein nährstoffreiches Flüssigmedium, eine 10%ige CO2- Atmosphäre, Antikoagulanzien und Inhibitoren der lysosomalen Aktivität und Phagozytose durch im Blut vorhandene Antikörper, Leukozyten, Komplementfaktoren, lytische Enzyme sowie Inhibitoren antimikrobiell wirksamer Substanzen [10, 14].

Voraussetzung zur mikrobiologischen Diagnostik einer katheterassoziierten Bakteri- oder Fungämie ist die Entnahme peripherer und zentraler Blutkulturen. Diese müssen zum gleichen Zeitpunkt entnommen und im Labor unter kontinuierlichem Monitoring gleichzeitig bebrütet werden. Durch die Ermittlung des Zeitpunkts des „Positivwerdens“ im kontinuierlichen Monitoring kann die so genannte „differential time to positivity“ (DTP) errechnet werden: Zeitpunkt BK peripher minus Zeitpunkt BK zentral. Eine DTP von mehr als 2 Stunden gilt hierbei als Hinweis auf eine katheterassoziierte Bakteri- oder Fungämie [2, 9].

Energiespektrum

Der Anteil der aus Blutkulturen isolierten Gram-positiven Bakterien wird mit 60-65% angegeben. Hier sind vor allem Koagulase-negative Staphylokokken gefolgt von Staphylococcus aureus zu erwähnen. An dritter und vierter Stelle finden sich Streptokokken- und Enterokokkenspezies. In der Gruppe der Gram-negativen Bakterien sind mit einem Anteil von ca. 30% aller positiven Blutkulturen Enterobacteriaceae, Nonfermenter und Bacteroides Spp. vertreten. Sehr selten kommen Bakteriämien durch Meningokokken und andere Gram-negative Kokken, andere Anaerobier oder andere Mikroorganismen vor. Die Angaben zum Anteil von Pilzen aus Blutkulturen schwanken zwischen 2 und 10 Prozent [4, 5, 16].

Automatisierte Verfahren

Automatisierte Blutkultursysteme basieren auf dem Prinzip des kontinuierlichen Monitorings während der Bebrütung. Während Bactec Systeme aus der Bactec 9000 Serie (Becton Dickinson) mittels Fluoreszenzmarker ein lineares Wachstum bzw. eine Änderung in der Fluoreszenzintensität detektieren, macht sich das BacT/Alert 3D System (Organon Teknika) eine kalorimetrische CO2-Messung zu Nutze. Das ESP Blutkultursystem (Trek Diagnostic Systems, Inc.) misst während des Bakterienwachstums die Veränderung verschiedener Gasgehalte im Flaschenkopf. Alle Systeme führen ihre Messungen und Aufzeichnungen kontinuierlich alle 10-20 Minuten durch, wobei die Gesamtbebrütungszeit 5 Tage nicht unterschreiten sollte [6, 11, 14]. In Einzelfällen kann eine Bebrütung über 3-4 Wochen notwendig werden, um beispielsweise seltene, langsam wachsende Endokarditiserreger aus der HACEK-Gruppe zu detektieren [8, 15].

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Diejenigen Blutkulturen, bei denen durch das Monitoring ein Wachstum verzeichnet wurde, werden manuell weiter bearbeitet. Ein Grampräparat und in einzelnen Fällen ein Antigennachweis durch Latexagglutinationstests (z.B. Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis und Streptococcus agalactiae) liefern erste orientierende Ergebnisse. In Abhängigkeit des aus 0,2 ml des Blutkulturmediums angefertigten Grampräparates werden Subkulturen auf entsprechenden Nährböden angelegt. Neben Schafsblut-, Kochblut- und Selektivnährböden, wie McConkey-, Endo- oder CPS-Agar, sollten auch anaerobe Kulturmedien eingesetzt werden.

Von den so angezüchteten Mikroorganismen werden im Folgenden eine Speziesidentifikation und eine Resistenztestung durchgeführt. Hierfür eignen sich automatisierte Verfahren, wie z.B. Vitek 2 (BioMerieux) oder Phoenix (Becton Dickinson). Bei besonderen Resistenzphänotypen werden zusätzlich Nachweise zur Bestimmung des Resistenzmechanismus geführt, um beispielsweise im Falle eines Methicillin-resistenten S. aureus (MRSA), eines Extended-spectrum beta-lactamases (ESBL)-bildenden Enterobakteriums oder eines Glykopeptid-resistenten Enterokokkenstammes (VRE) gezielte hygienische Maßnahmen einzuleiten. Vom Erhalt der Blutkulturflasche bis zur endgültigen Befundübermittlung vergehen je nach notwendiger Zusatzdiagnostik zwischen (24-), 48- und 72h, im Falle von besonders schwer kultivierbaren Erregern bis zu vier Wochen.

2003 evaluierten Ling et al. die Nutzung des Vitek 2 Systems zur direkten, schnellen Identifizierung und Resistenztestung Gram- negativer Bakterien aus der positiven Blutkulturflasche (BacT/Alert Microbial Detection System von Organon Teknika) ohne vorherige Subkultivierung. Die Untersuchung führte mit einer Übereinstimmungsrate gegenüber konventioneller Testung von 97,6% zu validen und reliablen Ergebnissen, sofern es sich um Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae handelte. In diesem Falle dauerte die Identifikation nach Positivwerden im Monitoring im Durchschnitt 3,3 h, die Resistenztestung zwischen 3,3 und 17,5h. Für Gram-positive und andere Erreger steht die Evaluierung jedoch noch aus [7].

Molekularbiologische Verfahren

Um den Faktor Zeit zu minimieren und somit den Beginn einer gezielten antimikrobiellen Behandlung, eventuell notwendiger hygienischer Maßnahmen sowie die Liegedauer zu optimieren, werden molekularbiologische Methoden getestet, die einen Direktnachweis aus dem entnommenen Patientenmaterial ermöglichen.

Ein neu entwickelter, von Wellinghausen et al. 2004 für die Blutkulturdiagnostik evaluierter Algorithmus erlaubt mittels real-time PCR mit Hilfe des LightCyclers (2nd generation LightCycler, Roche Diagnostics) eine schnelle direkte Detektion gängiger, klinisch relevanter Bakterien aus Blutkulturen. Abhängig vom Grampräparat werden die Primer (Oligonukleotide) für die jeweiligen Zielsequenzen, die auf flankierenden Bereichen speziesspezifischer Abschnitte der 16S rDNA liegen, eingesetzt. Für Bakterien, bei denen keine 16S rDNA Sequenz zu einer Speziesidentifikation führt, werden spezielle PCR Assays herangezogen, z.B. die Amplifikation und der Nachweis des Staphylococcus aureus Genabschnitts pSa-442 Sau3AI oder des Streptococcus agalactiae cfb-Gens.

Probleme liegen zum einen in der Aufbereitung der Bakterien-DNA aus den Kulturflaschen, vor allem wegen des Vorhandenseins humaner DNA, der Quantität der Erreger-DNA (Sensitivität zwischen 1fg und 10pg Bakterien-DNA) und der möglichen polymikrobiellen Besiedlung der Kulturflaschen. Den durch diese Methode entstehenden Kosten steht jedoch die kürzere Zeit bis zur Diagnosestellung, Therapieeinleitung und der Behandlungsdauer gegenüber [13].

Der kommerziell erhältliche Testkit Hyplex BloodScreen Multiplex PCR-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) System (BAG, Lich, Germany) ermöglicht die Identifikation gängiger Gram-positiver und -negativer Bakterien. Das nachweisbare Erregerspektrum umfasst im Bereich der Gram-positiven Bakterien S. aureus, S. epidermidis, E. faecalis/E. faecium, S. pyogenes, S. pneumoniae sowie das mecA Gen (Methicillin-Resistenz), im Gram-negativen Bereich E. coli, E. aerogenes, Klebsiella Spp. und P. aeruginosa. Mit Hilfe einer Multiplex PCR wird die bakterielle DNA im Thermal Cycler (Thermal Cycler Touch down, Hybaid, Ashford, United Kingdom) nach Herstellerprotokoll amplifiziert. Danach wird das Amplifikat auf einem ELISA basierenden Format hybridisiert. Hierfür wird das PCR Produkt auf die spezifischen Oligonukleotide aufgetragen und wie beim ELISA enzymmarkiert farblich sichtbar gemacht. Gemessen wird die optische Dichte in den Vertiefungen der Mikrotiterplatten.

Nach Positivwerden der Kulturflasche im automatisierten Monitoring dauert die Erregeridentifikation nur zwischen 4,5 und 6 Stunden [12]. Die Entwicklung von Mikroarrays dient der schnellen und spezifischen Erregerdiagnostik sowie dem Nachweis von Resistenzgenen und Virulenzfaktoren. Das zugrunde liegende Prinzip basiert auf der Nukleinsäurehybridisierung. Hierfür werden Gensonden (DNA-Sonden) auf spezielle Oberflächen (Glas-, Silizium oder Kunststoffe) gebunden, die Zielsequenzen aus dem Untersuchungsmaterial anhand der komplementären Basenfolge erkennen, binden und fluoreszierend markieren, damit diese im Laserlicht sichtbar gemacht werden können. Durch eine Vielzahl an verwendeten Sonden wird auf einem Testsystem eine so genannte Multiplex-Analyse ermöglicht, die zurzeit die gleichzeitige Analyse von 20000 - 40000 Genen ermöglicht. Durch die Sonden werden mehrere Regionen des Erregergenoms abgefragt und somit die Sensitivität und die Spezifität erhöht. Der Einsatz in der Blutkulturdiagnostik befindet sich ebenfalls in Erprobung [3].

Nachteile der molekularbiologischen Verfahren sind neben den zurzeit noch teueren Zubehören der hohe Aufwand durch die noch notwendige, parallel durchzuführende konservative Blutkulturdiagnostik. Es sollte vor allem ein Antibiogramm erstellt werden, da der Nachweis des Resistenzgenotyps alleine nicht in jedem Falle die ausreichenden Hinweise hinsichtlich einer gezielten antimikrobiellen Therapie gibt. Derzeit ist die Anwendung dieser Methoden großen universitären Laboren vorbehalten.

* Dr. U. Auerbach, IMMIH,Klinikum der Universität zu Köln, 50935 Köln

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